许多载体都具有一段大肠杆菌β半乳糖苷酶的启动子及其编码α肽链的DNA序列，此称lacZ’基因。LacZ’基因编码的α肽链是β半乳糖苷酶的氨基端的短片段（146个氨基酸）。宿主和质粒编码的片段各自都不具有酶活性，但它们可以通过片段互补的机制形成具有功能活性的β半乳糖苷酶分子。LacZ’基因编码α肽链与失去正常氨基端β半乳糖苷酶的突变体互补，这种现象称为α互补。由α互补而形成的有功能活性的β半乳糖苷酶，可以用Xgal（5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）显色测定出来，它能将无色化合物Xgal切割成半乳糖和深蓝色的底物5-溴-4靛蓝，因此，任何携带着lacZ’基因的质粒载体转化了染色体基因组存在着此种β半乳糖苷酶突变体的大肠杆菌细胞后，便会产生出有功能活性的β半乳糖苷酶，在IPTG(异丙基硫代β-D-半乳糖苷)诱导后，在含有Xgal的培养基平板上形成蓝色菌落。而当有外源DNA片段插入到位于lacZ’的多克隆位点后，就会破坏α肽链的阅读框，从而不能合成与受体菌内突变的β半乳糖苷酶相互补的活性α肽，而导致不能形成有功能活性的β半乳糖苷酶，因此含有重组质粒载体的克隆往往是白色菌落。
（1）X-gal（2）β-半乳糖苷酶（可分解X-gal、从无色变成蓝色）（3）lacZ的α-肽互补（4）IPTG诱导（lacZ的C端部分和α-肽互补基因都表达） Mcs有插入蓝斑，无插入白斑 全部都是白斑的原因：菌落、载体本身受到污染
4、质粒载体改造构建的指导思想 构建质粒载体一般原则
① 删除不必要的DNA区域,提高外源基因的装载量 ② 灭活某些质粒的编码基因及对质量复制产生负调控效应的基因(提高拷贝数) ③ 加入易于识别的选择标记基因,检测含有重组质粒的受体细胞。 ④ 在选择标记基因内引入具有多克隆街头,删除重复的酶切位点,使其单一化 ⑤ 根据外源基因克隆的不同要求,分别加装特殊的基因表达调控元件 5、常用的质粒载体类型 （1）克隆质粒载体（2）质粒载体（大肠杆菌表达型质粒载体、融合型蛋白表达载体pGEX-3X、非融合型蛋白表达载体pkk223-3、穿梭质粒载体）
穿梭质粒载体是一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，因而可以再两种不同的宿主细胞中存活和复制是质粒载体（是非）
6、λ噬菌体的克隆步骤：
（1）通过裂解过程增殖载体（λ-DNA感染E.coli 提取）由浑浊斑变成澄清（液体培养基）（2）载体与外源DNA的酶切（3）外源DNA与载体的连接（4）重组噬菌体的体外包装（5）包装噬菌体颗粒的感染（6）筛选
噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体包转序列，复制子以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体 7、野生型λ噬菌体的局限性
(1) 结构λ-DNA基因组大而且复杂，具有许多基因克隆常用的限制性酶识别 （2）λ噬菌体外壳只能接纳一定长度的DNA分子。 8、λ噬菌体的构建基本策略
（1） 缩短野生型的λ-DNA长度，提高外源DNA的有效装载量，根据切除的多少可将λ-DNA分成两大类载体：插入型
载体（一个限制酶切位点），取代型载体（2个限制酶切位点）
（2） 删除重复是酶切位点，引入单一的多酶切位点街头序列，增加外源DNA克隆的可操作性
（3） 灭活某些与裂解周期有关基因，使λ-DNA载体只能在特殊的实验条件下感染裂解宿主细菌，以避免可能出现的生
物污染现象的发生
（4） 引入合适的选择标记基因，便于重组噬菌体的检测 （5） 建立重组λ-DNA分子体外包装系统
9、Cosmid克隆载体（黏性载体/克斯质粒载体）：是一类由人工构建的含有DNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体
（1）Cosmid克隆载体结合了质粒克隆载体和λ噬菌体克隆载体的优点，克隆能力：31-45kb （2）Cosmid克隆载体三部分：质粒复制起点、抗性标记、cos位点
（3）Cosmid克隆载体的特征：①具有λ噬菌体的特性②具有质粒载体的特性③具有高装载能力 10、表达载体构建的一般原则 1 阅读框架与外源基因高效表达 2 启动子与外源基因高效表达
（1）外源基因在宿主细胞中的有效表达是基因工程的核心问题（2）外源基因的起始转录是基因表达的关键步骤 （3）转录起始的速率是基因表带的限速步骤
诱导型表达载体是指启动子必须在特殊的诱导条件下才有转录活性或比较高的转录活性的表达载体 3 转录的有效延伸和终止与外源基因的高效表达 （1）除去衰减子
（2）插入抗终止的序列 （3）强转录终止序列
4 有效的翻译起始与外源基因高效表达 5终止密码选择与外源基因高效表达 6外源蛋白的稳定性与外源基因高效表达
载体：原核生物基因克隆载体（细菌质粒载体、噬菌体克隆载体、Cosmid克隆载体、M13噬菌体载体）、酵母基因克隆载体、植物基因克隆载体、人工染色体载体
11、四种常用载体的比较（细菌质粒载体、噬菌体克隆载体、Cosmid克隆载体、M13噬菌体载体）
第四章：目的基因的分离与修饰
目的基因的基本分离制备法p169：直接分离法、基因文库分离法、PCR扩增法、差示分析法、DNA插入诱变法、基因定位克隆、标签测序法、化学合成法。 1、目的基因的制备直接分离法
1 限制性核酸内切酶酶切分离法：单酶切、双酶切、部分酶切
2 基因分离的物理化学法：密度梯度离心法、单链酶解法、分子杂交法 3 双抗体免疫分离编码蛋白的基因
4 利用酶促反转录法直接从特定mRNA分离基因 2、基因组文库与cDNA文库的主要区别：（重点）
① 基因组文库克隆的任何基因；cDNA文库克隆的具有蛋白质产物的结构基因， ② 基因组文库中的编码的是真实基因， cDNA克隆的是不含内含子的基因。 ③ 基因组文库克隆的全部遗传信息，不受时空限制；cDNA文库克隆的是不完全编码的DNA序列，受发育和调控因
子的影响即受时空限制。 ④ 从基因组文库中分离得到的基因片段很难直接用于体外的表达研究。但是它们对真核细胞基因结构的分析、基因表
达和调控的研究有着重要作用。cDNA文库中筛选分离的目的基因可直接用于表达，cDNA基因文库不能直接用于基因组DNA中的非转录区段的序列研究以及基因编码区外侧控序列的结构基因结构、组织和表达的强有力手段。 3、建库步骤：
基因组DNA DNA插入片段
重组DNA 转化宿主 文库扩增、保存 筛选
mRNA cDNA 载体DNA
4、λ噬菌体cDNA文库的构建
总RNA的分离 总RNA的纯化 cDNA第一链的合成 第二链的合成（方法p181） 甲基化 加衔接头 载体连接 λ噬菌体的包装导入 噬菌斑原位杂交 利用聚合酶链式反应（PCR）技术扩增目的基因
原理：利用聚合酶链式反应（PCR）技术，在体外特异性扩增某个基因 模板DNA变性
引物与DNA模板复性 DNA延伸 PCR过程： ① 反应系统加热至90-95℃，底物双链DNA变性称为两条单链DNA，作为互补链聚合反应的模板； ② 降温至37-60℃，使两种引物分别与模板DNA链的3’一侧的互补序列杂交（复性）； ③ 升温至70-75℃，耐热性DNA聚合酶催化引物按5’→3’方向延伸，合成模板DNA链的互补链。在退火下1min，引物优
先与DNA模板复性。 PCR特点
特异性高 敏感性高：需要的模板量极低，理论上一条模板链 快速：2-3h 简便：对模板纯度要求低，不需要纯化甚至可直接用细菌 可扩展mRNA）（反转录） 影响PCR的因素：
TapDNA聚合酶、其他耐热DNA聚合酶、引物、模板、dNTP、Mg离子浓度
引物是人工合成的单链DNA小片段，碱基顺序分别与所要扩增的DNA 双链的5’端相同，3’端序列互补。引物的3’端决定引物的特异性，3’端与模板DNA一定要配对；引物的5’端决定了PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大，因此5’端碱基并没有严格的限制。在PCR扩增中，对于引物来说，只要其3’端的序列有足够长度来启动延伸，而5’端含有不匹配的序列，并不影响正常的扩增。
引物5’端修饰：加酶切位点，引入突变位点，插入与缺失突变序列引入启动子序列 PCR产物积累规律示意图（笔记） PCR的相关技术 ① 反转录PCR（RT-PCR）：是将mRNA反转录与PCR技术相偶联的一种基因分离技术 ② 已知DNA序列的PCR扩增（各种方法概念比较） （1） 套式PCR是指用两对引物扩增同一样品的方法。
（2） 多重PCR是指利用多对引物同时扩增模板上的多个靶序列，以确定待检测的基因片段存在与否及其数量。 （3） 不对称PCR：两个引物能浓度比不同 ③ 已知cDNA一端序列获得全长cDNA的PCR扩增 （1） DNA末端的快速扩增（RACE）：指以mRNA为模板，反转录合成cDNA的第一条链，然后用PCR技术扩增出从某
个特点位点到3’端或到5’端之间的未知核苷酸序列。
（2） 锚定PCR（单侧PCR）：是指通过添加锚定引物街头的方式来扩增合成未知序列或未全知序列的方法。 ④ 已知侧翼序列的PCR扩增
（1） 反向PCR扩增利用两个靶序列引物对未知片段进行常规PCR扩增 （2） 锅柄PCR ⑤ 未知序列的PCR扩增
（1） mRNA差别显示技术或称差别显示反转录PCR （2） 代表性差异分析 （3） 抑制性消减杂交 ⑥ 定量PCR(差式PCR)通过PCR扩增来定量扩增体系中的DNA或RNA的起始拷贝数量 ⑦ 免疫PCR是一种具有非常高灵敏度的抗原检测系统，它将抗原检测系统与PCR偶联起来，通常的做法是将一段已知序
列的DNA片段标记到抗原抗体复合物上，在用PCR方法将这段DNA扩增，最后用常规免疫学方法检测PCR产物。 5、获得目的基因方法的选择
（1）根据获得目的基因的研究目的选择方法
①研究基因全长结构调控DNA信息分析 构建基因组文库
②开展目的基因重组表达 制药、治疗 构建cDNA文库 ③若目的基因序列明确，可设计引物通过PCR / RT-PCR克隆 ④ 若目的基因序列短小，可化学合成 （2）根据目的基因本身特点选择方法
① 对从基因组中克隆的基因（内含子） 只能真核表达
② 对从CDNA中克隆的基因（无内含子） 可在真核和原核表达 ① 要选择mRNA表达丰富的组织材料,PCR克隆的基因测序 （3） 根据实验室设备条件选择方法 ① 基因组文库不一定自行构建 ② 目的基因序列明确，无需建库，可直接由PCR / RT-PCR克隆
基于氨基酸或全蛋白序列的基因克隆
全蛋白序列
氨基酸序列 首尾两个核苷酸序列 抗体
核苷酸序列
一对合成引物
合成寡核苷酸 筛选表达文库
筛选(DNA)基因组文库 PCR扩增
目的基因 6、 如果已知某基因的一段DNA序列，如何获得该基因？
利用染色体歩移的方法以获得与已知序列相邻的未知序列，从而获得该基因 7、 如果已知某基因的两段DNA序列，如何获得该基因？
直接设计引物然后用延伸性好一点的酶直接PCR
8、已知蛋白质的部分氨基酸序列，怎样克隆编码该蛋白质的基因？
在蛋白数据库搜索同源蛋白,然后对应搜出的基因，设计引物PCR作出全长 9、已分离纯化某蛋白质并制备了相应的抗体，如何克隆其编码基因？
用抗体纯化出正在翻译的蛋白质， 得到其RNA，然后逆转录得到其DNA后设计引物然后进行PCR 10、如果已获得某基因的DNA序列，如何研究其结构功能？
第五章：重组基因导入受体细胞
1、以原核生物细胞表达真核生物基因存在的缺陷（必考）p209
1.有为数不少的真核生物基因不能在原核生物中表达出具有生物活性的功能蛋白，其原因是：原核生物细胞不具备真核生物的蛋白质折叠复性系统，即使真核生物基因能得到表达，得到的多是无特异性空间结构的多肽链。
2.原核生物细胞缺乏真核生物的蛋白质加工系统，而许多真核生物蛋白质的生物活性正是依赖于其侧链的糖基化或磷酸化等修饰作用。
3.原核细胞内源性蛋白酶易降解异源蛋白，造成表达产物不稳定。 至今被用作受体菌的原核生物有大肠杆菌、枯草杆菌、蓝细菌等。 2、受体细胞选择原则：（了解 特别是缺陷型p237）
（1） 便于重组DNA分子导入;
（2） 能使重组DNA分子稳定存在于细胞中; （3） 便于重组体的筛选；
（4） 遗传稳定性高，易于扩大培养或发酵生长
（5） 安全性高无致病性，不会对外界环境造成生物污染 （6） 选用内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低的细胞 （7） 受体细胞在遗传密码的应用上无明显偏移性
（8） 具有较好的转译后加工机制，便于真核目地基因的高效表达 （9） 在理论研究和生产实践上有较高的应用价值
3、重组体的转化
重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细内稳定维持和表达的过程称之为转化
受体菌染色体组进行复制，杂合区段亦随之进行半保留复制，当细胞分裂后，该染色体发生分离，形成一个新的转化子 E.coli的钙转化（钙离子诱导大肠杆菌转化法）
（1）制备受体细胞 感受态细胞是指处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态的细胞
菌种分纯活化，扩大培养 沉淀菌种（4℃5000g离心5min） 在含CaCl2的无菌预冷缓冲液中冰水浴15min 4℃4000g离心5min 弃上清液 沉淀物悬浮于含CaCl2的无菌预冷缓冲液中4℃下放置12-14h （2）DNA分子转化感受态细胞
0.2ml感受态细胞 加入NET缓冲液溶解的0.1mlDNA 轻摇几次 42℃水浴2min 37℃水浴中温育5min 加1ml不含选择药物的LB培养基 37℃振荡培养30-60min 涂平板培养筛选转化子 （3）转化处理过程中，可能感染杂菌，导致假阳性转化子的出现，因此转化处理过程中须设以下几种对照处理：（1）DNA 对照处理：0.2ml蒸馏水代替0.2ml感受态细胞，检验DNA溶液是否染菌（2）感受态细胞对照处理：0.1mlNET缓冲液代替0.1mlDNA溶液，检测感受态细胞是否染菌（3）感受态细胞有效性对照处理：0.2ml感受态细胞中加入0.1ml已知容易转化这种感受态细胞的质粒DNA E.coli的电穿孔转化
转化率是指DNA分子转化受体菌获得转化子的效率，有两种表示方法：（1）转化子数 / 用于转化处理的DNA分子数或质量（2）转化子数 / 用于转化处理的手提细胞数
转染：将重组λ噬菌体DNA分子直接导入受体细胞的过程
转导：是指通过λ噬菌体（病毒）颗粒感染宿主细胞的途径把外源DNA分子转移到受体细胞内的过程
体外包装：是指在体外模拟λ噬菌体DNA分子在受体细胞内发生的一系列特殊的包装反应过程，将重组λ噬菌体DNA分子包装为成熟的具有感染能力的λ噬菌体颗粒的技术
重组DNA分子导入植物细胞：农杆菌介导的Ti质粒载体转化法 重组DNA分子导入哺乳动物细胞：病毒颗粒转导法 4、重组DNA分子转入真核生物细胞方法
磷酸钙转染技术、电穿孔法、基因枪法、激光微束穿孔法、脂质体介导、病毒颗粒转导法、多聚物介导法
5、重组DNA操作一般步骤：
（1）分离：提取和获得目的基因 和载体DNA； （2）切割：分别对目的基因和载体DNA 酶切；
（3）连接：目的基因与载体连接， 形成新的重组 DNA分子； （4）转化：用重组DNA分子转化受体细胞；
（5）筛选：能在受体细胞中复制和遗传；对转化子筛选和鉴定；
（6）表达：对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。
6、遗传表型直接筛选法 1 根据载体选择标记初步筛选
一般的做法是将转化处理后的菌液（包括对照处理）适量涂布在选择培养基上，在最适生长温度条件下培养一定时间，观察菌落生长情况，即可挑出转化子
（1） 抗药性筛选p287 抗菌素等作为选择药物，几种常用的抗药性选择标记产物类型，如Ap、Cm、Kn、Tc等，
两种遗传表型的表示方法。观察和确定转化子菌落的培养世纪不宜过长，以12-16h为宜，否则会出现假转化子菌落。这是因为转化子菌落会降解选择药物，导致菌落周围选择药物浓度降低，从而长出非抗菌素的菌落。 实验组和对照组该不该长菌及其原因？
（2） 插入失活筛选法p288为什么要用双重标记？插入失活的具体做法。 （3） 插入表达筛选法p288例如pTR262质粒载体。
（4） 显色互补筛选法p290 X-gal 麦康凯培养基蓝白斑筛选；假若是麦康锴培养基，就不是蓝白斑，但筛选原理是
一样的。
由于被转化的基因产物作用于X-gal需要较长的时间，因此观察和确定转化子菌落是培养时间可适当延长。但必须严格挑单菌落作为转化子供进一步实验
（5） 利用报告基因筛选植物转化细胞p291
（6） 利用遗传选择标记筛选哺乳动物转基因细胞p293
2 营养缺陷型检测法p295转化进来的外源基因产物弥补受体菌的突变型缺陷，使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。如何利用选择性培养基进行筛选？
3 形成噬菌斑筛选法 免疫标记 蓝白斑标记p295将外源基因克隆到β-LacZ区段的插入型噬菌体上后，如何进行筛选重组噬菌体？
当外源DNA片段插入lacz’基因内时，重组噬菌斑无色透明，而非重组子噬菌斑则成蓝色 依赖于重组子结构特征分析的筛选法p296
1 快速裂解菌落鉴定分子大小：利用琼脂糖凝胶电泳时迁移速率的快慢鉴定重组子和非重组子。
2 限制性核酸内切酶酶解分析法：利用重组质粒电泳条带多一条鉴定重组子和非重组子；并根据酶切图谱分析其插入方向。 3利用PCR方法筛选确定重组子：提取质粒DNA进行PCR，再对其产物进行电泳确定是否是重组子菌落。
7、核酸分子杂交检测法
核酸分子杂交检测法实际上是一种依赖于重组子结构特征进行的重组子筛选方法 四类核酸分子杂交是技术路线
Southern印记杂交 Northern印记杂交 斑点印记杂交 菌落原位杂
提取DNA 提取RNA 提取DNA或RNA 按菌落或噬菌斑印迹到膜上 琼脂糖凝胶电泳 变性核酸
将核酸转移到膜上 核酸点到膜上 变性DNA
核酸固定到膜上
预杂交（清除非特异性吸附位点）
加入标记的探针杂交
漂洗膜（洗去非特异性结合的探针）
放射自显影或显色反应示踪 Southern与Northern的比较 Southern印记杂交 Northern印记杂交 靶核苷酸 DNA RNA 变性 DNA电泳前和电泳中不变性 RNA电泳前加热变性，电泳时加变性剂保持RNA处于变性状态 转膜 转膜前需用碱对其进行变性 转膜前不需要进行变性和中和处理 ELISA（酶联免疫吸附测定）的一般步骤（填空或选择）：固定样品、一抗结合、二抗结合、显色反应、比色 探针的概念及其三种制备方法：切口平移标记法、随机引物标记法（标记模板的互补链p311）、末端标记法
作为理性条件的探针需具备什么条件（1）标记物不会影响探针的主要理化性质（2）检测灵敏度高、特异性强、本底
低、重复性好（3）操作简便、省时，经济实用（4）化学稳定性高、易于长期保存（5）安全、无环境污染
8、免疫化学检测法：利用抗体作为“探针”来检测转入受体菌，并且表达出相应的蛋白质的外源基因，即蛋白质-蛋白质“杂交”。有抗体检测法和免疫沉淀检测法。 9、免疫化学杂交（概念）：
4.1抗体检测法：一抗、二抗和产物的结合进行检测 4.2酶联免疫吸附测定（ELISA）（非放射性抗体测定法）：概念及其检测的一般步骤。固定样品、一抗结合（决定限制性，此法的准确性）、二抗结合、显色反应、比色 4.3免疫沉淀检测法
4.4免疫印记法：关键是蛋白质电泳。
5、基因表达产物分析：①对于转录产物，用Northern印记杂交技术进行检测分析。②免疫化学检测基因产物：免疫沉淀检测法、酶联免疫吸附测定（ELISA）、Western印记杂交、固相放射免疫法。 10、如何选择合适的转化外植体？ （1）选择优良的种质及母株
无论是离体培养繁殖种苗，还是进行生物技术研究，培养材料的选择都要从主要的植物入手，选取性状优良的种质、特殊的基因型和生长健壮的无病虫害植株。尤其是进行离体快繁，只有选取优良的种质和基因型，离体快繁出来的种苗才有意义，才能转化成商品；生长健壮无病虫害的植株及器官或组织代谢旺盛，再生能力强，培养后容易成功。 （2）选择适当的时期
组织培养选择材料时，要注意植物的生长季节和生长发育阶段，对大多数植物而言，应在其开始生长或生长旺季采样，此时材料内源激素含量高，容易分化，不仅成活率高，而且生长速度快，增殖率高。若在生长末期或已进入休眠期时采样，则外