②植物病毒介导基因转移：如烟草脆裂病毒（TRV）转基因载体系统。 ③化学诱导DNA直接转化：多聚物介导法；脂质体介导基因转化；
④物理方法介导DNA直接转化：基因枪转化；超声波转化；激光微束穿孔转化；显微注射。 ⑤花粉管通道法：如涡流法、碳粉法等。 3）动物受体细胞：
①转染法：磷酸钙转染；DEAE-葡聚糖转染；聚阳离子-DMSO转染。 ②脂质体介导转化。 ③动物病毒介导转导法。 ④胚胎干细胞介导的转基因。 ⑤生殖细胞介导的转基因。
6.转化子与重组子的区别：通常我们将导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子；而含有重组子DNA分子的转化子称为重组子。 7.遗传表型直接筛选：
1）利用载体选择标记筛选转化子： ①抗药性筛选； ②插入失活筛选； ③插入表达筛选； ④显色互补筛选。
2）利用报告基因筛选植物转化细胞。
3）利用遗传选择标记筛选哺乳动物转基因细胞。 4）营养缺陷型检测。 5）噬菌斑筛选。
8.依赖于重组子结构特征分析筛选：
①快速裂解菌落鉴定分子大小；②限制性内切核酸酶酶解分析。
9.核酸分子杂交分析： （1）分子探针：
①放射性探针，常见的放射性探针有P、H、S、C、I等，其中以P、H、S最为常用；
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②非放射性探针：生物素标记探针、地高辛标记探针、荧光素标记探针； （2）标记探针的方法：切口平移标记法、随机引物标记法、末端标记法、PCR
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标记法、光敏标记法、化学衍生结合标记法、交叉相连标记法。
（3）核酸探针杂交分析：Southern印迹杂交；Northern印迹杂交；斑点印迹杂交和狭线印迹杂交；菌落（噬菌斑）原位杂交。
（4）影响探针杂交的因素：探针分子与目标分子之间序列的同一性；探针的长度；探针浓度；杂交加速剂；影响核酸分子杂交的因素还包括杂交漂洗液的组成、反应温度和盐浓度等。
第六章 外源目的基因表达与调控
1.基因表达的调控元件：
①启动子：原核生物的启动子；真核生物的启动子。 ②增强子。 ③终止子。 ④衰减子。
2.外源基因在大肠杆菌表达的形式：包涵体蛋白、融合蛋白、寡聚型外源蛋白、整
合型外源蛋白的表达、分泌型外源蛋白的表达。
⑤绝缘子。 ⑥反义子。
3.在大肠杆菌中高效表达目的基因的策略：优化表达载体的设计；提高稀有密码子
tRNA的表达作用；提高外源基因表达产物的稳定性；优化发酵过程。 4.外源目的基因的表达包括转录和翻译两个阶段。 5.外源目的基因表达产物的检测：
①外源基因转录产物的检测。 ②报告基因的酶法检测。
③免疫学检测：免疫沉淀法、酶联免疫吸附法、Western印迹法、固相放射性免疫检测（RIA）。
④基因表达产物生物学活性检测。 6.外源基因表达产物的分离纯化：
①细胞收集：
离心法收集细胞；过滤法收集细胞；絮凝法收集细胞；吸附收集细胞；自由流细胞电泳技术。 ②细胞破碎。
③基因表达产物的粗分离：
离心分离、蛋白质的盐溶和盐析、透析和超滤、凝胶过滤、等电点沉淀、有机溶剂提取、萃取。
④基因表达产物的纯化：装柱，柱平衡，上样，洗脱，样品收集。 ⑤基因表达产物的精细分离：电泳分离；亲和层析；高效液相色谱。
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