八、大肠杆菌转化方法
方法1：热击法。
(1) 准备。将已连接16h以上的连接体系65℃水浴处理10min，冰浴。从-70℃取出200ul
感受态细胞，冰浴化开。
(2) 吸附。取100ul感受态细胞加入5ul连接产物或质粒，快速轻轻混匀，冰浴静置
30min。
(3) 热击。42℃水浴热击60s，冰浴3min。
(4) 恢复。加入4倍体积无抗生素的LB培养基，混匀，37℃温浴。
若用Amp（蓝白斑筛选）来选择，则可立即涂菌； 若用Kan，则需37℃摇约1h。
(5) 涂菌。涂布前一般将菌浓缩为原感受态体积，即4000－5000rpm离心5min，去部
分上清，再用枪头吹吸均匀，最后涂布至培养基表面基本干燥为止。
若为蓝白斑筛选，则培养基除含Amp (每100ml培养基加入100mg/ml原液60-80ul) 外还需预涂布50ul X-Gal（20mg/ml）和5ul IPTG（200mg/ml）。
Kan培养基（50mg/ml原液1/1000使用）则可直接涂。 一般过夜培养前，需37℃正放1h，再倒放培养12h以上。
(6) 鉴别。对于蓝白斑，应挑取白斑划线，8h后菌落PCR鉴定，再挑取相应克隆摇菌
小提，酶切鉴定。酶切一般为25ul体系，质粒20ul。
九、农杆菌转化方法
方法1：冷击法。
(1) 准备。需用于农杆菌转化的已构建好的表达载体质粒。从-70℃取出200ul感受态
细胞，冰浴化开。
(2) 吸附。往200ul感受态细胞加入3-5ul质粒，快速轻轻混匀，冰浴静置5min。 (3) 热击。快速浸入液氮，维持5min，再37℃水浴5min。 (4) 恢复。加入4倍无抗生素的LB培养基，混匀，28℃摇2－4h。
(5) 涂菌。涂布前一般将菌浓缩为原感受态体积，即4000－5000rpm离心5min，去部
分上清，再用枪头吹吸均匀，最后涂布至培养基表面基本干燥为止。培养前，需28℃正放1h，再倒放培养48h以上。
(6) 鉴别。PCR效果不好，通常直接摇菌，再做质粒PCR，而质粒酶切效果也不好。
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