（2）甲苯标准溶液的制备：
准确量取2.9ml甲苯的标准品，加甲醇溶解后定容至5ml制成0.500mg/mL的标准溶液 ； （3）样品溶液的制备：
准确称取适量样品，加甲醇超声溶解，定容于100mL容量瓶中，过滤备用。 3．色谱条件
色谱柱： C18 分析柱
流动相：A 液：水；B 液：甲醇。用前用超声波脱气。 UV-检测器，检测波长254nm。
进样体积：20uL;流动相流速：1.0mL/min。 四、实验步骤
1．开启色谱仪，先开启泵、柱温箱、检测器，再开启系统控制器，最后开启电脑。 2．打开文件，设立新方法，设置流动相A 液和B 液的比例为10：90，流动相流量为1.0mL/min,柱温为30℃，检测波长为254nm，使其正常运行。 3.相对校正因子的测定：
取1.00mL甲苯标准溶液和1.00mL苯酚标准溶液混合，待仪器稳定后，注入10μL混合溶液，记录色谱图，平行测定三次。 f’=AsWi/AiWs 4.样品分析：
取1.00mL内标标准溶液和1.00mL样品溶液混合，待仪器稳定后，注入10μL混合溶液，记录色谱图，平行测定三次。 Wi=f’ Ai’ Ws’/As’
5．实验结束时，用甲醇冲洗色谱仪液路系统和注射器，然后按照与开机相反的顺序关机。 五、结果处理
六、注意事项
1.正确使用微量进样注射器，并保持其洁净。抽取试样时，注射器内部不得存留气泡，针头残存液体要用滤纸吸干。
2.吸取不同试液时，先用甲醇冲洗干净，再用要抽取的试液抽洗3 次后，方能抽取进样。使用完毕，须用甲醇抽洗干净后存放。
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实验十二 紫外差值光谱法测定废水中的微量酚
一、实验目的
1．了解紫外可见分光光度计的使用方法。 2．掌握紫外差值光谱法测定微量酚的基本原理。 二、实验原理
苯酚在紫外区有两个吸收峰，在中性溶液中?max为210nm和270nm，在碱性溶液中，由于形成酚盐，而使该吸收峰红移至235nm和288nm。所谓差值光谱就是指这两种吸收光谱相减而得到的光谱曲线。实验中只要把苯酚的碱性溶液放在样品光路上，把中性溶液放在参比光路上，即可直接绘出差值光谱。
在苯酚的差值光谱图上，选择288nm为测定波长，在该波长下，溶液的吸光度随苯酚浓度的变化有良好的线性关系，遵循比耳定律，即?A=???C?L，可用于苯酚的定量分析。差值光谱法用于定量分析，可消除试样中某些杂质的干扰，简化分析过程，实现废水中的微量酚的直接测定。 三、试剂和仪器
试剂：0.1M KOH溶液。0.2500g/L苯酚标准溶液。 仪器：紫外可见分光光度计。1cm厚石英比色吸收池2个。 25ml容量瓶12个 四、实验步骤
1．确定测定波长：以蒸馏水作参比，分别绘制苯酚在中性和碱性溶液中的吸收曲线。然后，将苯酚的中性和碱性溶液分别放置在参比和样品光路中，绘制二者的差值光谱曲线，根据该差值光谱曲线，确定其测定波长。
2．绘制标准曲线：用移液管分别移取苯酚标准溶液1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml于5个25ml的容量瓶中，另取同样体积苯酚标准溶液于另5个25ml容量瓶中，分别用水和0.1M KOH稀释至刻度（共需10个25ml容量瓶）。每对容量瓶所对应的溶液浓度分别是10mg/L、15mg/L、20mg/L、25mg/L、30mg/L。每一对苯酚标准溶液中的苯酚浓度相同，只是稀释溶剂不同。在测定波长下，把碱性溶液稀释的标准溶液放在样品光路上，把中性溶液稀释的标准溶液放在参比光路上，测定吸光度差值。
3．测量未知样品中苯酚含量：用移液管分别移取含酚水样10ml于2个25ml容量瓶中，分别用水和0.1M KOH稀释至刻度。在测定波长下，把碱性溶液稀释的待测试样放在样品光路上，把中性溶液稀释的待测试样放在参比光路上，测定吸光度差值。 五、数据处理
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1．用实验步骤2中测得的吸光度差值，绘制吸光度—浓度曲线，计算回归方程。 2．用吸光度—浓度曲线或回归方程，计算水样中的苯酚含量（mg/L）。 六、思考题
1． 苯酚的差值光谱图中有235nm和288nm两个吸收峰，为何选288nm作为测定波长？ 2．本实验所用的差值光谱法和示差分光光度法有何不同？
附录：TU-1910
紫外可见分光光度计操作规程
1． 打开仪器电源，仪器开始初始化，一切正常后进入主界面。 2． 选择光谱测量，按F1，进行参数设置：
（1） 光度方式：A （2） 扫描速度：快 （3） 采样间隔：1.0 （4） 波长范围：400?200nm （5） 纵坐标的范围：0.000?1.000
3． 按“RETURN”键，返回光谱测量界面，放入空白样品，按“AUTO ZERO”键进行基
线校正。然后，放入待测样品，按“START”键，进行光谱扫描。所得吸收光谱曲线显示在主机屏幕上，按F2，输入阈值，按“确认”，系统将自动检索并显示峰值。据吸收曲线选择最佳测定波长。按F4，可打印谱图。 4． 在主界面上，选“定量测定”，按F1，进行参数设置：
（1） 标样法
（2） 测量波长：287nm （3） 浓度单位：mg/L
5． 按F1键，进入标样法参数设置，、
（1） 按“1”，输入标样数：5
（2） 按“2”，标样序号：依次输入1-5#标样的浓度
（3） 在一号池中放入空白样，按“AUTO ZERO”键，进行行空白自动校零。 （4） 按“3”，将样品放入一号池中，按“START”键，测定吸光度。 （5） 重复（4）中的操作，直到5个样品测完。 （6） 按“4”，绘制工作曲线。
6． 按“RETURN”键，返回定量测量界面，放入空白样品，按“AUTO ZERO”键进行空
白自动校零。然后，放入待测样品，按“START”键，进行水样吸光度测量。界面自动显示测量结果。
7． 按“RETURN”键，返回主界面，直接关主机电源。
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