植物分类与资源学报??2011,33(1):91~100
:10.3724/SP.J.1143.2011.10247PlantDiversityandResources????????????????????????????????DOI
横断山地区海仙报春的谱系地理学研究
宋敏舒,乐霁培,孙??航,李志敏
生物多样性与生物地理学重点实验室,云南昆明??650204)
1,2
2
2
**1
*
(1云南师范大学生命科学学院,云南昆明??650092;2中国科学院昆明植物研究所
摘要:由于横断山地区特殊的地理效应,第四纪冰期气候的反复变化对该地区植物的地理分布和居群遗传结构产生重要影响。为了揭示该地区分布的物种的谱系地理结构,检测了该地区特有的、生于湿地环境的植物海仙报春(Primulapoissonii)的叶绿体trnL??F和trnT??L两个序列变异。共对13个居群167个个体的两个叶绿体片段进行测序,共发现11个单倍型。三种单倍型被共享,其他单倍型都只存在于单个居群内。分子变异分析(AMOVA)结果表明分布区内海仙报春的遗传变异主要存在于居群间(99.08%),且居群间的遗传分化很高(GST=0.916,FST=0.99077,NST=0.973),有着极显著的谱系地理学结构(NST>GST,P<0.01)和较低的居群间平均基因流(Nm=0.08)。结合嵌套分支分析(NCA),本文的研究结果推测该物种在冰期可能存在多个避难所,并没有表现出大多数温带植物在第四纪冰期所经历过的种群集体扩张和迁移的现象,异域片段化被认为是该物种现有单倍型分布格局形成的主要原因。海仙报春的谱系地理结构是气候的反复波动和横断山特殊的地理环境互相作用的结果。关键词:横断山;海仙报春;谱系地理学;叶绿体DNA;
trnL??F;
trnT??L
中图分类号:Q16,Q948??????????文献标识码:A????????????文章编号:2095-0845(2011)01-091-10
PhylogeographicalStudyonPrimulapoissonii(Primulaceae)*
fromHengduanMountains
Min??ShuSONG,Ji??PeiYUE,HangSUN,Zhi??MinLI
1,2
2
2
1**
(1SchoolofLifeScience,YunnanNormalUniversity,Kunming650092,China;2KeyLaboratoryofBiodiversityandBiogeography,KunmingInstituteofBotany,ChineseAcademyofSciences,Kunming650204,China)
Abstract:ThetopologicaleffectoftheHengduanMountains(HM)duringtheQuaternaryclimaticoscillationmusthaveimportanteffectsonspatialdistributionandgeneticstructureofplantsdistributedthere.Inthisstudy,weex??aminedthechloroplasttrnL??FandtrnT??LsequencevariationofPrimulapoissonii,arelativelycommonalpineperennialendemictothisregion.Elevenhaplotypesweredetectedbyanalyzing167individualsfrom13populationsofthisspe??cies.Onlythreeofthemarecommonlysharedwhiletheothersarerespectivelyfixedinthesinglepopulation.Anana??lysisofmolecularvariance(AMOVA)forpopulationsofP.poissoniishowedthatthegeneticvariationmainlyresidedamongpopulations(99.08%),andtheestimatesofinterpopulationdifferentiationwereveryhigh(GST=0.916,FST=0.99077,NST=0.973).Further,ahighlysignificantphylogeographicstructurewaspresent(NST>GST,P<0.01)whereasthevalueofaveragegeneflowwaslow(Nm=0.08)intheentiregeographicalrange.Alongwiththenestedcladeanalysis(NCA),ourresultsindicatethereweremultiplerefugiaforthisspeciesduringtheglacialsta??ges.Wefailedtodetecttheinterglacialorpostglacialrangeexpansioninthisspeciesascommonlyrevealedfortheothertemperateplants.Thenestedcladeanalysisindicatedthatallopatricfragmentationwaslikelythemajorproces??
***
基金项目:国家自然科学基金项目(40930209),云南省自然基金重点项目(2008CC013)通讯作者:Authorforcorrespondence;E??mai:llizhimin_vip@163.com收稿日期:2010-12-23,2011-01-07接受发表
作者简介:宋敏舒(1986-)女,硕士生,主要从事植物谱系地理学研究。??????????????????????????????????植物分类与资源学报????????????????????????????第33卷92
sesthatshapedthepresentspatialdistributionofhaplotypesinthisspecies.ThespecialphylogeographicstructureofP.poissoniimayhaveresultedfromacombinationofbothclimaticoscillationandcomplextopologyofHM.Keywords:HengduanMountains;Primulapoissonii;Phylogeography;ChloroplastDNA;trnL??F;trnT??L
??横断山位于青藏高原东南部,通常为四川、
影响。利用这种手段将有助于了解横断山地区植物分布格局以及可能存在的冰期避难所(Cheng
等,2005;IkedaandSetoguch,i2007;Meng等,2007;Wang等,2009)。DNA测序技术是目前谱系地理学研究中运用最广泛的技术之一,而植物谱系地理学研究主要集中研究叶绿体DNA(chloroplastDNA,cpDNA)片段,该基因组具有分子量小、单亲遗传、多拷贝、结构简单及碱基序列重组少等特点,有利于遗传分析。叶绿体基因的非编码序列不仅适用于分子系统学,同样适用于种内的谱系地理学研究(Schaal等,1998),并且由于cpDNA的单亲遗传使得其基因组在揭示种群范围变化及种群的历史动态方面非常有用(Newton等,1999;Schaal等,1998),尤其有利于揭示因为环境变化或冰期影响下的种群的变化及动态(Bartish等,2006;Petit等,2003;OkauraandHarada,2002;Fujii等,2002;Newton等,1999)。目前该领域的研究主要集中在北美及欧洲,Beheregaray(2008)的综述表明,近20年的谱系地理研究文献有77%涉及北美洲及欧洲的研究,主要是关于第四纪冰期避难所及冰期后种群扩张的研究,而中国西南山区及喜马拉雅地区属于研究较为薄弱的地区。近年来在横断山及青藏高原地区的谱系地理学研究上取得了不错的进展,如祁连圆柏(JuniperusprzewalskiiKom,Cupressaceae)(Zhang等,2005),青海云杉复合体(PicealikiangensisComplex,Pinaceae)(Meng等,2007)和露蕊乌头(Aconitumgymnandrum,Ranunculaceae)(Wang等,2009)等类群的研究揭示了中国-喜马拉雅地区的末次冰期存在多个避难所,这些类群通过改变它们的分布区域来响应第四纪气候的波动。而对条纹狭蕊龙胆(Meta??gentianastriata,Gentianaceae)(Chen等,2008),偏花报春(Primulasencudiflora,Primulaceae)(Wang等,2008)等草本类群的研究表明,横断山地区是第四纪冰期的避难所。
本研究所用的材料海仙报春(PrimulapoissoniiFranch.)隶属于报春花属灯台报春组(sec.tPro??云南两省及西藏自治区东部一系列南北向山脉的
总称,其山岭海拔2000~6000m,岭谷高差一般在1000~2000m以上(施雅风等,1998)。横断山地区地形复杂,多数地区存在纵向平行的山脉及被其分隔而成的河谷,从而使其生境强烈斑块化。该地区的是全球生物多样性的热点地区之一(BouffordandvanDijk,2004),植物区系十分丰富,据研究与统计约有189科、1500属和8590种,其中2783种为该地区特有(李锡文和李捷,1993;Zhang等,2009;ZhangandSun,2010)。研究表明,第四纪时期这一地区经历了4次大的冰期和间冰期作用,每次冰期和间冰期的作用都对这一地区南北成分融汇交流产生了深远的影响,进而使之成为现代温带和高山植物区系的中心(刘淑珍等,1986;Wu,1988),是许多重要的植物类群尤其是高山植物如杜鹃花属(Rhododendron)、龙胆属(Gentiana)虎耳草属(Saxifraga)、风毛菊属(Sausurea)及报春花属(Primula)等世界性大属的现代分布中心(吴征镒,1979,1980,1987;王文采,1992;李锡文和李捷,1993)。尽管我国在冰期并没有像欧洲、北极或者北美那样发生大规模的冰盖,但是在青藏高原地区这种气候波动影响了植物的分布范围,使其随冰期气候的波动发生进退。青藏高原的隆升和第四纪冰川造成的巨大的环境变化不仅改变了植物分布格局,而且也改变了物种种内的遗传结构(王献溥和刘玉凯,1994;孙航,2002;Wang等,2005;Liu等,2006;Zhang等,2005)。同时,吴征镒(1980,1987)提出横断山地区是第四纪冰期北温带植物的避难所,冰期后成为现代北温带植物的重要起源地和辐射地之一。
依托分子生物学技术建立起来的谱系地理学(Phylogeography)主要是通过直接检测物种不同居群DNA变异和谱系分析来探讨该物种曾经发生的种群扩散以及迁移路线,从而进一步推测该物种当前分布格局的历史成因,特别是能揭示出由于受第四纪冰期与间冰期反复交错的历史事件1期??????????
????????????宋敏舒等:横断山地区海仙报春的谱系地理学研究??????????????????????????????93
1.2??DNA提取和PCR扩增
????采用改进的CTAB法(DoyleandDoyle,1987)从硅胶干燥的叶片中提取总DNA,对cpDNA的trnL??F片段和trnT??L片段进行PCR扩增。PCR反应体系在20??L体积中进行,包括模板DNA10~40ng,缓冲液,
2??L10??PCR反应
1.6??LMgCl2(25mmol??L??1),1.6??LdNTP混
liferae),多年生草本,生于海拔2100~3500m的山坡草地湿润处和水边,该种植物主要在横断
山区的南部和东部(四川西部和云南西北部)分布,是典型的异花授粉植物。由于草本植物较短的生活周期以及对生活环境变化的敏感性,加上该种特殊的湿地生境,所以十分适合作为横断山区的一个模式种来研究高山植物的谱系地理学。在本研究中,我们选取了cpDNA的两个非编码片段trnL??F及trnT??L对海仙报春13个居群167个个体测序,进行谱系地理学研究,主要目的是通过初步取样的研究,揭示该植物单倍型的地理分布式样、居群遗传结构以及冰期时的避难所及冰期后的迁移路线。
合液(10mmol??L??1),正反引物各1??L(10??mol??L??1),TaqDNA聚合酶0.5单位。反应程序如下:先94??条件下变性4min,而后94??1min,
57??1min,
72??1min,
循环34次,最后在72??条件下延伸7min。扩增得到的PCR产物在1%的琼脂糖胶上电泳,在ABI3700DNAanalysissystem测序仪上测序。1.3??数据分析
????对167个个体的PCR扩增片段的全序列测序,用CLUSTAL_X1.81(Thompson等,1997)软件对测定的序列进行对位排列,并加以手工校对。用DnaSP4.0(Ro??zas等,2003)程序确定cpDNA单倍型。根据每个居群内不同单倍型的个体数目和总的个体数来计算单倍型频率,然后基于每个居群的单倍型组成、不同单倍型在每个居群的个体数目和单倍型序列变异位点,分别计算它们的遗传多样性HS和HT(分别为居群内和居群间平均遗传多样性)以及居群遗传分化GST(RaymondandRousset,1995)和NST值,依照Pons和Petit(1996)所描述的方法,用PERMUT软件计算。居群间的NST值用1000次置换进行置换检验。
1??材料和方法
1.1??实验材料
本研究材料采自四川西部及云南西北部,按居群采样标准对海仙报春所处地理分布范围进行取样,即每个居群随机采样7~15个个体,每个居群内采样个体之间至少间隔10m,共取得海仙报春13个居群167个个体(表1,图1)。野外采集生长良好,无病斑的幼叶,用硅胶快速干燥后带回实验室。凭证标本存于中国科学院昆明植物研究所标本馆(KUN)。选取同组的亲缘种玉山灯台报春(Primulamiyabeana)作为外类群。
表1??海仙报春13个居群材料来源及叶绿体DNA单倍型(H1??H11)的遗传多样性(Hd)组成和频率
Table1??Originofmaterials,measuremnetsofhaplotypesdiversity(Hd)andcomposition/frequencyfrom
cpDNAhaplotypes(H1??H11)in13populationsofP.poissonii
编号No.12345678910111213Total
居群
????????采集地
样本数size13157815151513151514815167
经度(E)101??23??102??12??101??10??101??18??99??45??99??52??99??16??99??47??99??46??99??59??100??11??102??37??101??01??
纬度(N)29??50??28??39??28??04??28??00??28??15??28??07??27??19??27??34??27??35??26??20??26??59??25??03??24??32??
海拔Altitude(m)2695335729853100367534602897325633672301294319253349
单倍型数目HaplotypenumberH5(13)H8(15)H5(7)H7(8)H9(15)H1(15)H10(14),H11(1)H1(13)H10(6),H1(9)H1(15)H6(14)H2(7),H3(1)H4(15)
单倍型多样性指数Hd0000000.133(0.11)
00.514(0.06)
000.250(0.18)
00.791(0.02)
核苷酸多样性指数
??0000000.000100.00039
000.00038
00.00305
Population????????Locality
JLMNML??AML??BWSZDWXXZD??AXZD??BEYLJKMJD
四川九龙Jiulong,Sichuan四川冕宁Mianning,Sichuan四川木里Mul,iSichuan四川木里Mul,iSichuan云南翁上Wengshang,Yunnan云南中甸Zhongdian,Yunnan云南维西Weix,iYunnan云南小中甸Xiaozhongdian,Yunnan云南小中甸Xiaozhongdian,Yunnan云南洱源Eryuan,Yunnan云南丽江Lijiang,Yannan云南昆明Kunming,Yunnan云南景东Jingdong,Yunnan
SampleLongitudeLatitude
??????????????????????????????????植物分类与资源学报????????????????????????????第33卷94
图1??海仙报春居群采样点及叶绿体DNA单倍型分布图,居群编号(1~13)与表1的编号一致Fig.1??ThesampledlocationsanddistributionofcpDNAhaplotypeswithinandamongpopulationsofP.poissonii.
Allofthepopulationcodesfrom1to13areaccordantwithTable1
????应用ARLEQUIN软件包version3.01(Excoffier等,2006)中的AMOVA(AnalysisofMolecularVariance)分析方法分别检测材料在分布区内居群内和居群间的遗传变异水平,以及单倍型分布的FST评价(WeirandCockerham,1984),以进一步分析居群的分化程度(1000次置换检验)。
*
应用PAUP4.0b10(Swofford,2003)软件用最大简
后从采样地点之间的地理距离计算Cladedistance(Dc)和Nestedcladedistance(Dn)。Dc是同一单倍型(分支)的个体与此单倍型分布地理中心的平均地理距离;Dn是同一单倍型(分支)的个体与上一层分支地理中心的平均地理距离。在嵌套分支范围内没有地理联系的零假设用Geodis2.5(Posada等,2000)软件进行分析。通过比较末端分支(tipclade,位于网状进化树边缘、只与一个单倍型相连的分支,简称T)与内部分支(interiorclade,位于网状进化树内部、与多个单倍型相连的分支,简称I)的Dc和Dn观测值、或在嵌套分支范围内用1000次MonteCarlo置换的零分配对采样地点的内部-末端分支(interior??tipclade,
I??T)的Dc和Dn比较时
进行检测。如果内部与末端的Dc和Dn差异不显著,零假设不能被推翻,表明居群之间没有地理相关性;如果内部与末端的Dc和Dn差异显著,零假设被推翻,表明居群之间存在地理相关性,则需要进一步推断居群之间的谱系地理关系。Templeton(2004)的检索表用于推断单倍型变异之间的可能的时空联系。
物种水平上的居群间的平均基因流(Nm)、单倍型多样性指数(Hd)、核苷酸多样性指数(??)(Ne,i1987)以及Tajmia??sD(Tajmia,1989)、Fu和Li??sD*
(FuandL,i
1993)两种无限突变位点模型的中性检验方法检测及失配分约性分析法(maximumparsimony,MP)进行单倍型系统发育分析,以亲缘种玉山灯台报春(P.miyabeana)作为外类群,空位(gap)作为缺失处理,采用启发式搜索,
1000次随机加入序列,TBR枝长交换,每步保留10棵树。得到的一致性系统树分支的可靠性使用??靴带??(Bootstrap)分析,用1000次重复来检验单倍型各分支的支持率值。
种内单倍型间嵌套分支分析(NCA)参考Templeton等(1992)的方法,利用TCSversion1.2(Clement等,2000)软件进行构建。这种方法应用溯祖理论(Coales??centtheory)来推测单倍型间的亲缘关系。当网状图中间出现了闭合环状结构时,我们使用基于溯祖理论的一种方法和原则进行解释(CrandallandTempleton,1993;TempletonandSing,1993)。单倍型间的地理相关性首先用Templeton和Sing(1993)在嵌套范围内对采样地点的置换分支类型进行嵌套可能性检测的方法进行评估,然1期??????????
????????????宋敏舒等:横断山地区海仙报春的谱系地理学研究??????????????????????????????95
析,又称歧点分布(Mismatchdistribution)分析(RogersandHarpending,1992)都在DnaSP4.0程序中完成。
平很高(GST=0.916),并且有着明显的谱系地理学结构出现。分子变异分析(AMOVA)的结
果表明,居群间的遗传变异为99.08%,而居群内的遗传变异为0.92%,FST=0.99077(P<0.001)(表3),进一步揭示了海仙报春的遗传变异主要存在于居群间,而且具有较高的居群分化水平。通过DnaSP4.0程序计算得出居群间的平均基因流为0.08,说明居群间基因交流不频繁。在种的水平上对叶绿体DNA进行的失配分析,得到的失配曲线为多峰曲线(图2),背离了对快速扩张模型的假设,这个结果在两种基于无限位点
2??结果
2.1??序列变异
对13个居群167个个体进行了叶绿体非编码DNAtrnL??F和trnT??L片段的全序列测定,通过排序发现,trnL??F片段长度为940~946bp,trnT??L片段长度为448~460bp,两片段联合长度1406bp,共检测到11个单倍型(H1??H11)。这11种单倍型变异位点见表2。2.2??多样性指数、遗传结构分析及失配分析
在海仙报春的13个居群总的单倍型多样性指数Hd为0.791(0.023),核苷酸多样性指数??为0.00305。其中单倍型H1的频率最高,有52个个体拥有此单倍型。每个居群的遗传多样性(Hd)、单倍型数量、单倍型组成及频率见表1,单倍型的地理分布情况见图1。
通过PERMUT程序计算得出海仙报春居群内平均遗传多样性HS值、总的遗传多样性HT值、居群间遗传分化GST和NST值分别为:0.078(0.0445)、0.925(0.0431)、0.916(0.0500)和0.973(0.0172)。使用U??统计方法对海仙报春整个分布区单倍型变异的地理结构进行检验后发现NST极显著的大于GST(U=1.95,P<0.01),表明在海仙报春分布范围内,居群间的遗传分化水
图2??海仙报春所有个体叶绿体DNA两个片段
联合数据的失配分析
Fig.2??MismatchdistributionforsequencesdataoftwocpDNAfragmentfromallindividualsofP.poissonii.Thethinrepresentstheexpectation;Thedottedlinerepresentstheobservedvalue
表2??海仙报春2个叶绿体片段11个单倍型间的序列变异位点
Table2??VariablesitesofthealignedsequencesoftwochloroplastDNAfragmentsin11haplotypesofP.poissonii
变异位点VariableSites
单倍型Haplotype
18
166GCCCCGCCGGG
174------??----1
205CTCCCCCCCCC
242CCCCTCTCCCC
252TCCCCTCCTTT
271TTTTTTTTTAA
295---------??-2
315-----??-----3
460CCCCCCCTCCC
475GGGGAGAGGGG
488CCACCCCCCCC
557????????????-????????
4444444444
702-??????---??---5555
744GAAAGGGAGGG
772---??-------6
805????????-??-????????
777777777
827AAAATATACAA
828AAAAAACAAAA
927????????????-????????
4444444444
1117-??????---??---5555
1160GAAAGGGAGGG
1187---??-------6
H1H2H3H4H5H6H7H8H9H10H11
CTTTCCTCCCT
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77777777
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