无菌技术与微生物分离培养
一、
实验室的主要仪器和常用器皿介绍
1．主要仪器
天平、光学显微镜、干热灭菌用电烘箱、高压蒸气灭菌锅、培养箱、冰箱、摇床、离心机、分光光度计、pH计、水浴锅、细菌过滤器、磁力搅拌器等。 2．常用玻璃器皿
试管、培养皿、三角瓶、吸管、量筒、漏斗、烧杯、烧瓶、试剂瓶、滴瓶、干燥器、载玻片、盖玻片 3.其它器具
接种环、接种针、接种钩、试管架、铝锅、染色缸、玻璃刮刀、洗瓶、注射器、酒精灯、硅胶塞、滤纸、pH试纸、纱布、棉花、包扎绳。 二、
普通光学显微镜观看细胞示范
光学显微镜可分辨大于0.2um的物体，有一定的适用范围。如果有更高的实验要求可以选择扫描电子显微镜、透射电子显微镜、扫描隧道显微镜。 （附观察到的细胞视野图片） 三、
器具洗涤与干燥
1、洗涤剂
a.肥皂、洗洁精、洗衣粉是很好的去污剂，用于除去器皿上沾有的少量油脂。
去污粉含有碳酸钠、碳酸镁，具有起泡和除油垢作用；硼砂增加了摩擦作用，使去污能力增强。
b.重铬酸盐洗涤液，是一种强氧化剂，去污能力很强，常用来洗去玻璃和瓷质器皿上的有机物。 c.酸碱洗涤剂
1) 稀释3倍的盐酸。除去铁锈、碳酸钡、钙盐及其他金属氧化物污污痕。
2) 稀释3倍的硝酸。用于塑料器皿和沾污硝酸银器皿的洗涤。
3) 5.0g乙二酸溶于100mL10%的硫酸溶液，经加热可洗去盛过高锰酸钾的容器内壁上的
棕色二氧化锰。
4) 碱性乙醇溶液。用30%氢氧化钠和等体积乙醇配制而成，用于清洗有油垢的玻璃器皿
和瓷质器皿。具有强腐蚀性，使用时小心。 d.其他有机洗涤剂
常用的有汽油、丙酮、乙醇、乙醚、苯、松节油、四氯化碳，可用于洗脱油脂、树脂、脂溶性染料等。二甲苯可洗脱油漆。
洗涤剂的种类很多，根据要求或污染物的性质选择有效的洗涤剂。 四、
器皿的干燥
常用干燥方法有室温晾干、烘箱烘干、吹干。
五、
器具的灭菌方法
灭菌前准备：a.玻璃器皿用报纸包扎。b.离心管、小试管等装入大烧杯，用报纸封口橡皮条扎口。c.三角瓶用封口纸封口包扎。d.培养基在三角瓶或蓝盖瓶内配制好封口。 注意：1、液体在蓝盖瓶中灭菌时，用锡铂纸包住瓶口。灭菌前把瓶盖稍稍拧开。2、与菌接确过的器皿，要先灭菌再清洗。且灭菌时不可与其它器具一起灭菌，需要单独灭菌。 1.火焰灭菌：简单地将接种针、镊子、试管口等用具直接利用火焰把微生物灼烧而死的方法。
2.干热灭菌：在电烘箱中利用干热的空气进行灭菌的方法。微生物细胞内的蛋白质，在无水时于160℃开始凝固变性而达到灭菌的目的。水分含量越高，蛋白质凝固越快，反之，
越慢。所需温度是160-170℃，时间约2h，但是，不能超过180℃，否则，包器皿的纸或棉塞会烧焦，甚至引起燃烧。
3.高压蒸气灭菌：将待灭菌的物品放在密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使锅隔层间的水沸腾成为蒸汽，随着灭菌锅内蒸汽压力的升高，使沸点增高，温度也升高。最终使菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。
注意：1、一般培养基用121℃，20-30min即可达到彻底灭菌的目的。2、有些培养基，如牛乳、明胶等，因温度过高会变质。采用115℃，15-20min即可。3、一些含有糖的培养基用112℃，以免温度过高引起糖的炭化或分解。4、土壤灭菌比较困难，需铺成薄层，121℃ 2h,或135℃ 1h。总之，灭菌条件依具体情况而定 3.过滤除菌法：对于含热不稳定的物质，如血清、维生素、糖类等，可用过滤方法得到无菌的滤液。所用滤器叫到细菌过滤器，是由孔径极小、能阻挡细菌通过的特制多孔介质，如陶瓷、硅藻土、石棉、玻璃砂等制成。
4.辐射灭菌法：紫外线、X射线、γ射线在一定剂量下可以杀死微生物。X射线、γ射线的穿透力强，主要用于药物和食品的灭菌。由于对人体有害，操作时要有一定的防护措施。 六、培养基
1、按营养划分：天然培养基、半合成培养基、合成培养基。
2、按状态划分：液体培养基，不加凝固剂；半固体培养基，液体培养基中加入少量琼脂（0.3-0.6%）；固体培养基，加入凝固剂。
3、按用途划分：基础培养基，营养要求相似的微生物所需要的物质接近，除少数几种外，绝大多数物质是相同的；选择培养基，在一定的培养基中加入某些物质或除去某些营养物质以阻止一般腐生性微生物的生长，而只满足一个类群或某一种微生物的生长； 七、土壤中固氮菌和解钾细菌的分离培养
牛肉膏蛋白冻培养基：牛肉膏3.0g, 蛋白冻10.0 g, NaCl5.0 g, 水1000 mL,
pH7.0-7.2。
解钾细菌培养基：蔗糖5.0 g，Na2HPO4·12H2O 2.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，
FeCl3·6H2O 0.005 g，CaCO3 0.1 g，钾长石矿粉 1.0 g，琼脂 18.0 g，水 1000 mL，pH 7.0-7.5。 *钾长石矿粉单独灭菌
瓦克斯曼77号培养基：葡萄糖 10.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，K2HPO4 0.5 g，
MnSO4·4H2O 1%溶液2滴，NaCl 0.2 g，FeCl3·6H2O 1%溶液2滴，1%刚果红 5.0 mL，琼脂 18 g，水 1000 mL，pH 7.0。 *1%刚果红溶液过滤除菌后加入培养液。
土壤中固氮菌和解钾细菌的分离操作步骤：
1).称取10.0 g土壤，用100 mL蒸馏水溶解，磁力搅拌器搅拌10min，取上清液，即土壤浸提物的稀释倍数为10-1。
2).把土壤上清液稀释成系列梯度：10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7. 10-1 5 mL 10-2 4.5 mL 10-3 4.5 mL 10-4 4.5 mL 10-5 4.5 mL 10-6 4.5 mL 10-7 4.5 mL 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL 3).取相应稀释倍数的上清液各100uL，加入到固体培养皿（提前制备好，备用）中，再用玻璃刀抹均匀。
4）.固体培养皿放在25℃培养箱中培养一周，观察菌落。
5）.挑目标菌斑，用接种针划线到另一个固体培养皿中，培养一周得到单克隆菌落。即完成了土壤中特定细菌的分离培养。
6）.用牛肉膏蛋白冻液体培养基扩大培养，摇菌到OD600值在0.6时，用40%甘油1：1混均，-80℃保存。 作业要求：
1、实验报告一份。
2、附观察到的细胞视野图片。
3、附分离得到的细菌固体培养皿菌斑图片。