1 引言
1.1 荧光分子探针的定义与荧光产生过程
1.1.1 荧光分子探针的定义
荧光探针是能和个别组织特异结合而又不干扰其他组织成分自身荧光的那些荧光
化合物。荧光探针大多是含有共扼双键体系的有机化合物，共辆双键使其容易吸收激发光，其激发波长多处于近紫外区或可见光区，发射波长多处于可见光区。 作为荧光探针应该具有以下特点：第一，荧光探针的荧光必须与生物样品的背景荧光易于区别；第二，荧光探针必须不干扰研究的主体；第三，荧光探针主要用于生物活体或在天然生物条件下的体外样品的研究，所以荧光探针的毒性、使用的pH范围，生物相容性等方面都有严格的要求[1-2]。 1.1.2 荧光产生过程
分子具有不同的能级，电子处于不同的能级中，当特定光照射到分子上，电子被激
发，从低能级跃迁到高能级。含有处于较高能级电子的分子为激发态分子，不稳定，高能级电子通过辐射跃迁和非辐射跃迁失去能量返回基态。荧光就是伴随着处于激发态的分子或原子返回基态过程中放射出来的一种光能。
一般来说，荧光试剂分子处于基态（S0），当有外部光源照射时，试剂分子吸收了光子能量（hvEX）后跃迁到第一电子激发态（singlet state, S1）。这种激发态存在的时间有限一般为（1～10）×10-9s。在此期间，试剂分子发生构象变化，并可能受到分子相互作用的影响。S1的能量部分散失，产生一种驰豫的最低振动能级的单激发态（relaxed singlet excited state, S1）， 当分子从 S1发生辐射跃迁到基态，放出光子，这时就产生了荧光[3]。
1.1.3 化合物3的合成及表征
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OOHONH2NH2H2OEtOH,refluxNNH2HONONONNONN1SeO2NOHOONOH2CHONONN?
图解1化合物3的合成路线
化合物3的合成如图解1所示。中间体罗丹明B肼（化合物1）及化合物2根据文献[4-5]合成。将39.1 mg (0.086 mmol)化合物1和9.8 mg (0.057 mmol)化合物2溶于3 mL乙醇，再滴加2滴醋酸，然后在50℃下搅拌1 h，减压蒸出溶剂。将粗产品用200-300目的硅胶柱分离纯化，洗脱剂为石油醚（沸点：60-90℃）/乙酸乙酯（3:1, V/V），得到32.4 mg浅黄色固体，产率90.2%。熔点：236-238 ; 1H NMR (400 MHz, CDCl3), δ = 8.65 (s, 1H), 8.11-8.01 (m, 4H), 7.54-7.49 (t, J = 8.8 Hz,2H), 7.39-7.35 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.26-7.23 (t, J = 7.0 Hz, 1H), 7.17-7.15 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.10-7.08 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.57-6.54 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.49(s, 2H), 6.26-6.24 (d, J = 7.6 Hz, 2H),3.35-3.30 (t, J = 6.8 Hz, 8H), 1.17-1.14 (t, J = 6.8 Hz, 12H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): 153.1, 152.6, 152.1, 149.1, 145.9, 137.5, 135.9, 133.9, 128.4, 128.1, 127.9, 124.0, 123.7, 118.8, 117.7, 110.0, 108.0, 105.5, 98.0, 66.1, 44.3, 12.6. ESI-MS m/z = 612.3 [M+H]+, calc. for C36H33N5O3 =611.3;
1.2 铜离子的危害、检测方法以及铜离子探针的研究进展
1.2.1 铜离子的危害
近年来，生物体内、环境中金属离子，尤其是过渡金属离子的检测跟踪引起了人们的广泛关注。而铜离子，作为人体生命活动过程中一种重要元素，其在水溶液中的定向检测和测量更是受到了极大的关注。铜是维持生物体正常生命活动不可缺少的必需微量元素之一，它的含量虽然很少，但起着非常重要的作用。当机体内铜离子浓度超出或低于细胞所需的浓度范围时就会扰乱生命系统的正常活动而使细胞中毒，从而引起严重的铜代谢障碍疾病，比如肝豆状核变性疾病(Menkes Wilson disease)。阿耳茨海默氏早老性痴呆病(Alzheimer’s disease)。朊病毒疾病(Prion diseases)。环境中微量的铜离子污染，可以通过生物链作用而产生富集[6]。
当人饮用或食用受铜离子污染的水和食物,导致体内铜离子含量过高时，便会引发
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各种不治之症。因此，对自然环境和生物体内铜离子的检测[7-8]就十分有必要。 1.2.2 现有铜离子检测方法概况
迄今，国内外学者对铜离子的测定进行了大量的研究。常规的测定铜离子的方法主要有催化荧光光度法、碘量法、火焰原子吸收法、萃取光度法、差分脉冲伏安法等。
催化荧光光度法
根据张淑静[9]等人的研究结果表明，在氨水-氯化铵缓冲介质中，过氧化氢氧化靛蓝胭脂红的反应产物有荧光，痕量铜(Ⅱ)对该反应有明显的催化作用，建立了催化荧光光度法测定痕量铜的方法。方法的灵敏度高，选择性好，用于大米、面粉和茶叶中痕量铜的测定，获得满意结果。
碘量法
碘量法是一种常见的实验室的测铜离子的方法，原理很简单，利用淀粉作指示剂，加入过量KI溶液，然后Na2S2O3进行反滴定的过程。董晶[10]提出物质性质决定了化学分析的分析操作条件。了解和熟悉物质性质有助于理解分析操作条件确定的原因，在实际分析操作过程中可以更加准确地控制分析操作条件，从而提高分析结果的准确度。
火焰原子吸收法
闵翔[11]等人通过采用双毛细管动态标准加入法测定复杂基体中铜，可以消除常规火焰原子吸收法测铜时由于样品基体复杂和校准曲线基体差异太大使结果准确度降低的情况，又可以使传统标准加入法的烦琐步骤得以简化，方法简便快速，试剂消耗少。
萃取光度法
二乙二硫代甲酸钠(DDTC) 萃取光度法在我国为测定水质铜的标准分析方法之一，标准法中介绍：“在氨性溶液中(pH 9~10) 铜与二乙氨基二硫代甲酸钠作用，生成摩尔比为1∶2的黄棕色络合物。”其缓冲溶液的配制为：“称取氯化铵70 g溶于适量水中，加入570 mL 氨水，用水稀释至1 000 mL。”经王强会[12]等人的研究表明，经计算并用酸度计测定，该缓冲液的pH值都大于10 ，这与标准法所介绍的9~10是有些不相符的。
差分脉冲伏安法
常焕球[13]等人用铅笔芯作为电极材料制成了供常规分析用的亚微盘电极。研究发现，在浓氨水介质中，二价铜离子在自制的亚微盘工作电极上于+0.09V
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现性好，几乎不存在残留效应，结果令人满意。 1.2.3 铜离子探针的研究进展
1997 年，Czarinik [14]等合成了罗丹明B酰肼，其可以选择性识别铜离子，该荧光探针是基于铜离子催化罗丹明B酰肼水解生成强荧光的罗丹明B分子的。
2006 年，Aijun Tong[15]等合成水杨醛罗丹明B酰腙，可以可逆性的荧光增强识别铜离子。也就是说，在缓冲溶液中，当加入铜离子时，内酰胺螺环状结构被打开，吸收和荧光增强，当加入络合剂EDTA 时，化合物表现出没有吸收和荧光，而在此时再加入铜离子，荧光恢复。
2007年，Yasuhiro Shiraishi[16]等人，合成了乙二胺乙酞乙酸罗丹明B衍生物，当该探针与铜离子发生作用的时候，会产生绿色的荧光，并发生蓝移(45 nm)，其它离子如汞离子也可引起荧光增强，但最大发射波长不会移动。
Yang等通过在酸性条件下罗丹明B-酰肼与硫氰酸甲间的一步反应合成了一种Cu2+荧光探针。向该探针的乙腈/水溶液中添加Cu2+后，会造成荧光分子内酰胺键断裂，从而引起体系的荧光和紫外吸收明显增强。利用该探针实现了水相中Cu2+荧光和紫外检测，方法的线性范围分别为0.2~0.4 和0.5~10 μmol/L。他们将该方法应用于自来水中Cu2+含量的测定，测定结果与原子吸收光谱方法测定结果一致。
Zhao等在2009年设计合成了一种新型罗丹明类酰胺衍生物5，并将其应用于水溶液和活体细胞中Cu2+的检测。这种比色探针对铜离子的反应是瞬时可逆的，并且在其它金属离子浓度很高的情况下也不会对铜离子的比色和荧光信号产生干扰，这一特征使其很好地满足了生物医学和环境监测方面的特殊要求。目前，该类探针已广泛应用于环境体系中铜离子浓度的检测和生物活细胞铜离子分布成像实验，其优异的综合性能预示了极好的应用前景[17]。
2 实验部分
2.1 主要仪器和试剂
Hitachi F-2500 型荧光分光光度计
日本日立公司
U-3010 紫外分光光度计 日本日立公司 PHS-3E 型精密pH计 FC104 电子天平
上海第三分析仪器厂
上海精密科学仪器有限公司 北京亚力思科学器材公司
UV-Ⅲ三用紫外分析仪
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罗丹明B-8-羟基-喹啉 - AR 实验室合成 三羟甲基氨基甲烷
-AR
国药集团化学试剂有限公司
盐酸 AR 湖南省株洲市化学工业研究所
CuCl2·2H2O -AR 湖州化学试剂厂
Ag+，Al3+，Ca2+，Cd2+，Co2+，Cr3+，Fe2+，Fe3+，K+，Mg2+，Na+，Zn2+的可溶性盐均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。
2.2 实验方法
2.2.1 溶液的配制
5×10-4 mol/L 化合物3溶液（即母液）的配制：用称量纸准确称取探针0.0031 g并转入10 mL比色管中，往比色管中加入无水无醇（AR 天津市恒兴化学试剂制造有限公司）至刻度线，充分摇匀，密封，备用。
pH=7.00的tris-HCl缓冲溶液的配制：准确称取三（羟甲基）氨基甲烷（AR国药集团化学试剂有限公司）1.5141 g于烧杯中，加入适量蒸馏水溶解并转移至250 mL容量瓶中，加蒸馏水水稀释至刻度下约1cm处，用稀HCl（AR 湖南省株洲市化学工业研究所）调节至pH=7.00，并摇匀。
3×10-2 mol/L的Cu（Ⅱ）标准储备液的配制：准确称取CuCl2·H2O（AR）0.0512 g
于10 mL比色管中，加入10 mL蒸馏水溶解并充分摇匀。
3×10-3 mol/L的Cu（Ⅱ）标准储备液的配制：准确移取1 mL3×10-2 mol/L的Cu2+ 标
准储备液于10 mL比色管中，并加入9 mL蒸馏水充分摇匀。
3×10-4 mol/L的Cu（Ⅱ）标准储备液的配制：准确移取1 mL3×10-3 mol/L的Cu2+ 标准储备液于10 mL比色管中，并加入9 mL蒸馏水充分摇匀。
以下储备液的配制方法同上：
3×10-2 mol/L 的S（Ⅱ）标准储备液的配制：准确称取Na2S·9H2O（AR，天津市恒兴化学试剂制造有限公司）0.7205 g；
3×10-2 mol/L 的Ag(Ⅰ) 标准储备液的配制：准确称取AgNO3（AR 湖南高纯化学试剂厂）0.0510 g；
3×10-2 mol/L 的Al(Ⅲ) 标准储备液的配制：准确称取Al2(SO4)3（AR）0.1999 g。 3×10-2 mol/L 的Ca(Ⅱ) 标准储备液的配制：准确称取准确称取CaCl2（AR 天津市化学试剂公司）0.3330 g；
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