Genloci Classic CRISPR-Cas9内部操作流程
IV． FAQ
Q-1：靶位点设计有哪些注意事项
A-1：目前有几个在线设计软件，我们推荐使用Zhang Feng lab：http://crispr.mit.edu/，该软件会对每一个潜在的靶位点打分，并告知是否存在脱靶现象。在设计Guide序列时，需要特别注意第一个碱基必须是G，如果您选取的Guide序列的第一个碱基不是G，需要自行加上一个G，因为这个G对于起始转录非常重要。
Q-2：转染效率低，怎么办？
A-2：因为Cas9蛋白比较大，就导致整个敲除质粒较大（8kb左右），如此大的质粒很容易导致转化效率低下，尤其是使用脂质体等化学试剂转染时，转染效率会比较低些。所以，我们推荐使用电转的方法进行转染。Bio-Rad的电转仪器需要根据不同的细胞单独配制转染buffer，所以不推荐使用；Life的Neon系统不错，但是因为耗材是镀金的，所以非常贵；而Genloci的CTX-1500A电转仪，转化效率高，不需要单独配制buffer，只需使用无血清的培养基就行，而且该电转仪的耗材也是相对比较便宜的。
Q-3：单个细胞不生长，怎么办？
A-3：对于单细胞不长的细胞进行敲除，首先建议采用共培养的方法看看能否促进单个细胞的生长。共培养可以采用培养过同种细胞的培养基培养单细胞；也可以使用Cell PlazaTM（单细胞培养板），可以把细胞的存活率提高三倍以上。如果以上方法都不行，建议对细胞进行改造，加快其分裂速度，让单细胞可以很容易生长后，再对目的基因进行敲除。具体方法可以联系Genloci的客服做进一步的了解。
Q-4：在做高通量样本时，如何才能快速筛选得到阳性克隆？
A-4：建议使用错配酶进行筛选，可加快筛选的流程。目前市面上主要有三种错配酶：CruiserTM酶、T7E I和Surveyor酶。其中，CruiserTM酶和Surveyor酶属于Cel I家族，这两种酶的筛选特异性比T7E I高。在酶切筛选过程中，T7E1的特异性较差，容易出现假阳性的结果，这在一定程度上阻碍了阳性克隆的筛选进度；Surveyor酶较贵，并且货期较长，所以我们推荐CruiserTM酶，它特异性高且价格合理。
Protocol No. PT140726-1
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VI．附录
附录A pGK1.1 linear Vector
以下为pGK1.1的插入位点示意图和质粒图谱，线性化pGK1.1所用的酶为BbsI。
： pGK1.1
Guide RNA：
～20bp
Figure 3. pGK1.1插入位点图示
Figure 4. pGK1.1质粒图谱
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VII CruiserTM操作说明
1，操作步骤
1） 基因组 DNA 的准备
提取细胞的基因组 DNA，推荐使用 Genloci 公司专为阳性克隆筛选设计的 TNA 抽提试剂盒（Cat. No.: GL10851S），只需 500 个左右的细胞即可提取全基因组 DNA，详细实验步骤请参看 Genloci TNA 抽提试 剂盒（Cat. No.: GL10851S）说明书。
2） 杂交 DNA 的准备
a) 第一轮和第二轮（巢式）PCR 引物设计
分别设计 First Primers 和 Nested Primers。其中 First Primers 要求具有较高的特异性，其扩增产物推 荐为 500～1000 bp，Nested Primers 推荐扩增产物长度为 300～600bp。First Primers 和 Nested Primers 引物对应目的序列的位置如下：
模板 DNA
第一轮 PCR 产物
第二轮（巢式）PCR 产物
1/3 突变 位点 2/3 Nested Primer First Primer
Protocol No. PT140726-1 Genloci Biotechnologies Inc.
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b) 第一轮 PCR：获得目的片段
将已经提取的基因组作为模板，使用 First Primers，以高保真 DNA 聚合酶扩增获得目的片段，要求目 的片段明亮（允许少量杂条带，以及少量弥散）。同时获得野生型模板扩增产物和突变型模板扩增产物。 推荐扩增循环数 35～40 cycles，反应体系 25 μl，100 ng≤模板量≤300 ng。PCR 完成后，取 7～8 μl 进
行电泳检测。
c) 第二轮（巢式）PCR：获得杂交 DNA
根据第一轮 PCR 电泳检测中目的条带的亮度，用无菌去离子水稀释扩增产物（可参照 Marker 的亮度 估算产物中 DNA 的浓度，稀释至总核酸浓度为 10～20 ng/μl，一般需要稀释 10～50 倍）。其中野生型模 板扩增产物标记为：WT DNA；待检测的突变型模板扩增产物标记为：MT DNA；根据您的检测样本量的大 小取合适量的稀释产物作为第二轮 PCR 的模板。小量样本的反应体系如下：
MT DNA WT DNA 5×Nested Buffer Mg2+ Buffer
dNTP（10mM each） Nested Primer-F Nested Primer-R GNest DNA polymerase ddH2O Total Volume
大量样本的反应体系如下：
2.5 μl 2.5 μl 5 μl 1.5 μl 0.5 μl 1.2 μl 1.2 μl 0.3 μl 10.3 μl 25 μl 1 μl 1 μl 2 μl 0.6 μl 0.2 μl 0.5 μl 0.5 μl 0.1 μl 4.1 μl 10 μl
MT DNA WT DNA 5×Nested Buffer Mg2+ Buffer
dNTP（10mM each） Nested Primer-F Nested Primer-R GNest DNA polymerase ddH2O Total Volume
※注意：
? 若第一轮 PCR 的扩增模板为混合模板，即同时含有野生型和突变型模板，则在第二轮 PCR 无需混合
WT DNA，取稀释后的扩增产物 2 μl 作为第二轮 PCR 的模板。 ? GNest DNA polymerase 置于-20℃保存，且避免操作污染。在 60 s 内，GNest DNA polymerase 可扩 增
1 kb 的 DNA 片段。
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PCR 反应程序推荐如下：
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94℃ 94℃ Tm* 72℃ 72℃ 95℃
自然冷却 40℃以下
*Tm 值由 Nested Primer 决定，一般为55℃左右。
#
#
45 s 10 s 10 s 15-30 s 45 s 3 min 10 min
35 cycles
产物片段长度≤500 bp 时，建议为 72℃，15 s；产物片段长度＞500 bp 时，建议为 72℃，30 s。
扩增结束后，取 2 μl PCR 产物（实验组）用于下一步 CruiserTM 酶切检测。
3） CruiserTM 酶筛选阳性克隆
对照组和实验组杂交 DNA 同时进行 CruiserTM 酶切，步骤如下： 1. 取一个新的 0.20 ml 的 PCR 反应管，加入 2 μl Positive control DNA，此为阳性对照组； 2. 分别向实验组和对照组反应管中加入 CruiserTM 核酸酶和 5×CruiserTM 缓冲液，总体积为 10 μl，移 液器吹打混匀，此步骤应置于冰浴上操作。酶切体系如下： 3. 将实验组和对照组置于 PCR 仪中 45℃孵育 15～20 min。
PCR Products 5×CruiserTM Buffer CruiserTM Enzyme ddH2O
Total Volume
Incubation Temperature Incubation Time
2 μl 2 μl 1 μl 5 μl 10 μl 45℃ 15～20 min
※注意：CruiserTM 核酸酶、阳性对照置于-20℃保存，且避免操作污染。
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