*具有更长的半衰期（达220分钟） *对PCR无抑制 *干冰运输 *Tdt活性更低
SuperScriptⅢ反转录酶
9. 为什么有人更喜欢用SSⅢ而不是ThermoScript？
ThermoScript如果保存不当会引起活性很快降低，SSⅢ则更稳定。 10. 为什么使用基因特异性引物（GSP）？
GSP在扩增低丰度的转录本时是最好的。OligodT引物建议用于高质量RNA及全长转录本的逆转录；随机引物用于mRNA片段的逆转录。 11. 什么情况下需要使用RNase H？
在第一轮PCR中RNA/DNA杂合体不能正常变性时 12. 根据不同的目的选择不同的系统： 目的建议
RT与PCR使用不同的引物 或需要灵活选择PCR DNA聚合酶 两步法RT-PCR系统 高灵敏度
一步法或两步法RT-PCR系统 高特异性
含有适当的DNA聚合酶的两步法RT-PCR系统 或具有高保真Platinum Taq酶的一步法RT-PCR系统
高保真度
含有Pfx Taq酶的两步法RT-PCR系统
长的反转录结果
通常使用两步法RT-PCR系统可达到最佳结果 含Elongase酶的一步法RT-PCR系统
二、Generacer
1. 如何针对Generacer试剂盒设计基因特异性引物（GSP）？
使用5’或3’RACE试剂都需要至少一条基因特异性引物，您在设计引物时需要注意以下几点要求：
*50-70％的GC含量，以提高引物熔点（Tm） *23-28个碱基长度，以提高引物特异性
*降低3’端GC含量，将引物非特异性结合的可能性降至最低 2. 为什么得不到RACE产物？ *加入Hela对照 *低质量的RNA模板
*逆转录失败，SSII和SSIII非常适用于长模板cDNA的合成
*目的基因丰度太低，可以通过提高PCR的循环次数来解决，建议使用巢式PCR *目的基因没有表达，可以通过使用两条GSPs来分析cDNA中是否含有目的基因 *目的基因太长而不适合进行反转录，建议使用GeneRacer试剂盒中的Oligo dT来得到全长cDNA，使用随机引物或与模板的5’端尽可能近的GSP进行PCR。
*cDNA模板属于困难模板，可以通过以下方法解决：优化PCR反应参数及反应体系；降低退火温度；使用5-10％的DMSO帮助通过高GC含量区；使用高保真度和高延伸能力的酶进行PCR反应。
3. RACE的PCR结果有杂带
RACE PCR杂带或非特异性PCR条带可能是由于以下原因：
*GSP与其他cDNA的非特异性结合会导致在扩增目的产物时得到无关产物。 *GeneRacer引物和cDNA的非特异性结合会导致产生一端带有GeneRacer引物序列的PCR产物。 *RNA降解。 *PCR管或试剂污染。
注意：杂带一般是因为没有优化PCR条件，可以加入阴性对照来确定。 4. 得不到全长的5’RACE PCR产物
*CIP反应后的RNA降解产生了新的带有5’磷酸的断裂模板，可以同GeneRacer RNA
Oligo连接。一定要小心操作，保证RNA无降解。
*CIP脱磷酸不完全，可以增加反应中CIP的量或减少RNA的量。 *PCR产生了杂带，并不是真正的连接产物，可以使用上述建议优化PCR。
三、PCR 在进行PCR时：
*请确保您没有使用过量的起始DNA或者过高浓度的引物，也没有加入过量的Mg++ *请确保您使用了恰当的退火温度 *请确保您没有使用过量的DNA聚合酶 四、引物
1. 应该选择哪种纯化方法？ 取决于实验目的和引物的长度
2. 为什么我订购了50nmol，但是收到却只有40nmol？ 50nmol是起始量
3. 怎样制备100μM的储液？
体积（μl）=质检报告上的nmol数目×10 4. 怎样设计引物？
*一般长度20-30bp； *至少50%的GC含量； *避免引物二聚体和二级结构； *引物对的Tm值应该接近。 5. 引物序列有插入或缺失？ *使用上游和下游引物多测几个克隆。 *请选择正确的纯化方法。 6. PCR无结果？
*请检查引物设计是否正确； *请检测OD读数是否正确； *做一个阳性对照和一个阴性对照。