四川友谊医院
作业指导书 SOP 常规石蜡包埋组织制片 制备标准操作流程 文件编号：SOP-BL-01-02 版本：A/0
常规石蜡包埋组织制片制备
标准操作流程
1)制备程序 1．水洗。 2．脱水。 3．透明。 4．浸蜡。 5．包埋。 6．切片。
2)注意事项
组织切片制备及其HE染色过程中使用的乙醇、丙酮、二甲苯、石蜡等为易燃、有毒物，必须专人管理，2m以内不得有明火，局部环境应有良好的通风和消防设施。
3)常规切片的手工操作
1．水洗 用流水冲洗已经固定的组织块30min。 2．脱水(常温下)
(1)乙醇—甲醛(AF)液固定：60～120min。 (2)80％乙醇：60～120min。 (3)95％乙醇I：60～120min。 (4)95％乙醇Ⅱ：60～120min。 (5)无水乙醇I：30～60min。 (6)无水乙醇Ⅱ：30～60min。 (7)无水乙醇Ⅲ：30～60min。
注意事项：①未经充分固定的组织不得进入脱水程序；②用于脱水的试剂容积应为组织块总体积的5～l0倍以上；③自低浓度乙醇向高浓度乙醇逐级移进脱水；④脱水试剂应及时过滤、更换(500ml乙醇可用于500个组织块脱水；加入硫酸铜的无水乙醇变蓝时，提示需要更换)；⑤较大组织块的脱水时间长于较小者，应将两者分开进行脱水；⑥组织块置于无水乙醇内的时间不宜过长(以免硬化)；⑦丙酮脱水性能强，会使组织块过缩、硬脆，不宜用以替代无水乙醇。
3．透明
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(1)二甲苯I：20min。 (2)二甲苯Ⅱ：20min。 (3)二甲苯Ⅲ：20min。
注意事项：①二甲苯的容积应为组织块总体积的5～10倍以上；②组织块在二甲苯中透明的时间不宜过长(以防组织硬、脆)，并依不同种类组织及其大小而异(组织块呈现棕黄或暗红色透明即可)；③二甲苯应及时过滤、更换；④组织块经二甲苯适度处理后不显透明时，常提示该组织的固定或脱水不充分，应查找原因并妥善处理。
4．浸蜡
(1)石蜡工(45～50℃)：60min。 (2)石蜡Ⅱ(56～58℃)：60min。 (3)石蜡Ⅲ(56～58℃)：60min。
注意事项：①熔化石蜡必须有专人负责，必须在熔蜡箱内或水浴中(70℃)进行，不得用明火加温；②熔蜡的容积应为组织块总体积的5～10倍以上；③组织块经二甲苯适度透明后方可转入浸蜡过程，应尽可能减少将透明后组织块表面的二甲苯带人熔蜡中；④浸蜡时间适宜，过短时浸蜡不充分(组织过软)，过长时组织硬脆；⑤熔蜡应及时过滤、更换。
5．包埋
(1)先将熔化的石蜡倾人包埋模具中，再用加热的弯曲钝头镊子轻轻夹取已经过浸蜡的组织块，使组织块的最大面或被特别指定处的组织面向下埋入熔蜡中，应将组织块平整地置放于包埋模具底面的中央处。包埋于同一蜡块内的多块细小组织应彼此靠近并位于同一平面上；腔壁、皮肤和黏膜组织必须垂直包埋(立埋)。
(2)将与组织块相关的病理号小条置人包埋模具内熔蜡的一侧。 (3)待包埋模具内的熔蜡表面凝固后，即将模具移人冷水中加速凝固。
(4)从包埋模具中取出凝固的包埋蜡块(简称蜡块)，用刀片去除组织块周围的过多石蜡(组织块周围保留l～2mm石蜡为宜)。将包埋蜡块修整成为规则的正方形或长方形。
(5)将病理号小条牢固地烙贴在蜡块一侧(编号应清晰可见)。 (6)把修整好的蜡块烙贴在支持器上，以备切片。 (7)使用包埋机的方法按有关厂商的说明书操作。 (8)注意事项。
①应将组织块严格分件包埋。包埋时一定要首先认真核对组织块的病理号(包括次级号)、块数和取材医师对包埋面的要求，准确地置入相应的病理号小条。发生包埋差错时，必须立即与取材医师和病理科当班负责人取得联系，及时处置。
②必须严防各种异物污染，勿将无关组织如缝线、纸屑或其他异物(尤其是硬质异物)埋人蜡块内。 ③包埋过程要操作迅速，以免组织块尚未埋妥前熔蜡凝固。
④包埋用的熔蜡应纯净，熔点适宜。浸蜡I用软蜡(熔点为45～50℃)，浸蜡Ⅱ、Ⅲ和包埋用蜡均用硬蜡(熔点为56～58℃)。
⑤包埋用熔蜡使用前应先静置沉淀、过滤。
⑥熔蜡时不得使用明火，以防燃烧。包埋用熔蜡的温度应<65℃；包埋用的镊子不可加温过高，以免烫伤组织。
6．切片
(1)切片刀或一次性切片刀片必须锋利。使用切片刀时，必须精心磨备(在低倍显微镜下确认刀刃无缺口)；使用一次性切片刀片时，应及时更新。
(2)载玻片必须洁净、光亮。
(3)将切片刀或刀片安装在持刀座上(以15度为宜)。
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(4)将蜡块固定于支持器上，并调整蜡块和刀刃至适当位置(刀刃与蜡块表面呈5度夹角)。 (5)细心移动刀座或蜡块支持器，使蜡块与刀刃接触，旋紧刀座和蜡块支持器。
(6)修块(粗切)。用右手匀速旋转切片机轮，修切蜡块表面至包埋其中的组织块完整地全部切到。修块粗切片的厚度为15～20／μm[注意：对于医嘱再次深切片(特别是在原切片中发现了有意义病变而进行的深切片)，应尽量少修块，以尽量好地获得有关病变的连续性]。
(7)调节切片厚度调节器(一般为4～6μm)，进行切片。切出的蜡片应连续成带状，完整无缺，厚度适宜(3～5μm)、均匀，无刀痕、颤痕、皱褶、开裂、缺损、松解等。
(8)以专用小镊子轻轻夹取完整、无刀痕、厚薄均匀的蜡片，放人伸展器的温水中(45℃左右)，使切片全面展开[注意：必须水温适宜、洁净(尤其是水面)；每切完一个蜡块后，必须认真清理水面，不得遗留其他病例的组织碎片，以免污染]。
(9)将蜡片附贴于涂有蛋白甘油或经3—氨丙基—三乙氧基硅烷(3—aminopropyl-triethoxy silane，APES)处理过的载玻片上(HE染色时酌情使用，可省略)。蜡片应置放在载玻片右(或左)2／3处的中央，留出载玻片左(或右)1／3的位置用于贴附标签。蜡片与载玻片之间无气泡。
(10)必须立即在置放了蜡片的载玻片一端(待贴标签的一端)，用优质记号笔或刻号笔准确、清楚地标记其相应的病理号(包括次级号)[注意：必须确保载玻片上的病理号与相关组织石蜡包埋块的病理号完全一致，不得错写或漏写病理号]。
(11)将置放了蜡片的载玻片呈45度斜置片刻；待载玻片上的水分流下后，将其置于烤箱中烘烤(60～62℃，30～60min)，然后即可进行染色。
(12)注意事项。
①组织块固定、脱水、透明和浸蜡的质量直接影响切片制备。切片过程中遇到的困难首先应注意从切片前的上述各环节中寻找原因。
②切片机的质量是制备优质切片的重要前提。要使用质量好的切片机，规范地切片，精心维护切片机。 ③经由内镜、穿刺等获取的细小组织，应间断性连续切片多面(一般至少制备6张蜡片，必要时制备更多张)。须做特殊染色、免疫组化染色等的病例，可预制蜡片备用。
④切片人员应细心操作，防范被切片刀具割伤。
4)常规切片的自动组织处理机操作程序 组织处理
步骤的次序和各步骤的持续时间，总计需要14h。 1．乙醇—甲醛(AF)固定液 2× 60min。 2．95％乙醇Ⅰ 2×60min。 3．95％乙醇Ⅱ 2×60min。 4．无水乙醇Ⅰ 60min。 5．无水乙醇Ⅱ 60min。 6．二甲苯Ⅰ 30min。 7．二甲苯Ⅱ 30min。 8．石蜡Ⅰ 30min。 9．石蜡Ⅱ 60min。 10．石蜡Ⅲ 90min。
本科室常规切片的自动组织处理及操作，全自动封闭式脱水机脱水程序处理大标本小标本混合的脱水程序。
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1．10%Formalin 7 h (40℃) 2．80%Alcohol 1 h 3．95%Alcohol 30 min 4．95%Alcohol 45 min 5．100%Alcohol 35 min 6．100%Alcohol 35 min 7．100%Alcohol 35 min 8．100%Alcohol 40 min 9．100%Xylene 35 min 10．100%Xylene 40 min 11．Paraffin 20min (62℃) 12．Paraffin 45min (62℃) 13．Paraffin 45min (62℃) 14．Paraffin 10min (62℃)
处理小标本的脱水程序 1．10%Formalin 5 h 以上 2．80%Alcohol 30 min 3．95%Alcohol 20 min 4．95%Alcohol 20 min 5．100%Alcohol 30 min 6．100%Alcohol 20 min 7．100%Alcohol 30 min 8．100%Alcohol 30 min 9．100%Xylene 30 min 10．100%Xylene 30 min 11．Paraffin 20min (62℃) 12．Paraffin 30min (62℃) 13．Paraffin 30min (62℃) 14．Paraffin 10min (62℃)
处理大标本的脱水程序 1．10%Formalin 9 h (40℃) 2．80%Alcohol 1 h 3．95%Alcohol 30 min 4．95%Alcohol 45 min 5．100%Alcohol 35 min 6．100%Alcohol 35 min 7．100%Alcohol 35 min 8．100%Alcohol 40 min 9．100%Xylene 35 min
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10．100%Xylene 40 min 11．Paraffin 20min (62℃) 12．Paraffin 45min (62℃) 13．Paraffin 45min (62℃) 14．Paraffin 10min (62℃) 石蜡包埋 方法一：
1． 埋时先将融蜡倾入模型，然后以钝头热镊夹取组织块，使病灶或指定面向下（包埋分层次的组织在蜡中
安放平正。注意防止混杂组织碎屑；
2． 埋入蜡块中以后，即将该组织的号码小条埋入蜡块一侧； 3． 稍凝后，即移入冷水中加速凝固；
4．蜡块的大小，以在组织周围包有1~2mm之蜡为宜。蜡块做成正方形或长方形，以便切片。
方法二：
1．织从脱水机内取出放入已将石蜡融化的自动包埋机槽内，再将打有号码的装有组织块的包埋盒按号码顺
序依次包埋，并与包埋取材记录登记表核对无误。先倾入融化的石蜡，再用眼科小镊将组织夹入包埋用铁模具，并应尽量使组织平整地放置在包埋模具的中央；包埋于同一蜡块内的多块组织应彼此靠近并位于同一平面上，腔壁、皮肤和粘膜组织必须垂直包埋（立埋）。
2．包埋好的组织移到包埋机的冰冻台上，待包埋盒的蓉蜡表面凝固后，即可放入冰水中加速凝固。 3．从包埋盒中取出凝固的包埋蜡块（简称蜡块）。
4．将蜡块按包埋盒上的号码按顺序排列并核对蜡块数目，看包埋好的蜡块与取材时登记的数目是否一致。 5．使用包埋机的方法按厂商的说明书操作。
6．用组织包埋机时，按有关厂商说明书的规定操作。
7．切片 参见上文“(三)常规切片的手工操作”。 注意事项：
(1)必须按有关说明书的规定，使用和维护自动组织处理机。
(2)要严防因停电、机械故障等造成的组织块损坏。一旦发生此类事故，必须及时向病理科主任报告，尽快采取应急措施妥善处置。
(3)使用自动组织处理机时：①合理设定运行时间(充分利用夜间)。②固定、脱水的环境温度不得>30℃。③乙醇、二甲苯和熔蜡的容积，要大于组织块总体积的5～10倍以上，并应经常过滤，保持清洁；应经常检查试剂的浓度，及时更新。④对于多量组织块，可按其大小分批进行处理；小块组织可适当缩短处理时间。
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