吉林化工学院
生物工程专业实验报告
实验题目：四环素族抗生素定向发酵
Tetracycline antibiotics directional fermentation
课程类型： 生物工程专业实验 实验类型： 设计型 专业班级： 学生姓名： 学生学号： 合作者： 指导教师：
提交日期： 2015年11月23日
吉 林 化 工 学 院
Jilin Institute of Chemical Technology
四环素族抗生素定向发酵实验
摘要：通过金色链丝菌在不同培养基中产生不同的产物，了解定向发酵的意义。
另外通过实验更进一步学会根据抗生素生物合成的不同途径寻找各种抑制剂或促进剂，以调节某些酶的活性,从而改变代谢途径。四环素和金霉素都能在酸性条件下加热生成黄色脱水四环素和脱水金霉素其产生黄色的深浅与它们的含量多少成正比。所以通过反应比色即可知道二者地总含量（预先要做好四环素浓度的标准曲线），称其为总效价。
关键词：金色链丝菌、定向发酵、四环素族抗生素、金霉素、总效价 前言：定向发酵是指通过改变培养基的组分(如加入某些物质)改变微生物代谢
途径，使发酵按主观要求产生较多的某种产物。金色链丝菌能同时产生四环素和金霉素，这二种抗生素在分子结构上只是在第七位上差一个氯离子。四环素族抗生素族抗生素包括金霉素、四环素和土霉素，它们的化学结构极为相似：
当R1为Cl,R2为H时分子为金霉素；当R1和R2都为H时为四环素；当R1为H，R2为OH时为土霉素（羟基四环素）。金霉素比四环素只多一个氯离子，只要在发酵液中加入某些物质，阻止氯离子进入四环素分子，从而使菌种产生较多的四环素。
从生物合成途径上可知四环素和金霉素有一段相同的生物合成途径，到某一个中间产物时，氯化酶活力的大小可能决定其合成途径的改变，所以我们设计从控制氯化酶的活性和氯化酶的量来影响菌种的代谢途径，从而得到不同的产物。本实验是通过在改变培养基的组分，来实现定向发酵。我们从下面两个方面考虑:
（1）抑制氯化酶的活力
1
利用硫醇基苯骈噻唑（M-促进剂）与氯化酶的激活剂－二价铜离子作用，降低铜离子的浓度，从而使氯化酶的活力下降。
（2）利用竞争性抑制剂来减少氯化酶的量
加入一种基质，其能与某一反应的酶作用，使此反应的酶量减少，从而使此反应受到抑制的现象一般称竞争抑制。
本实验利用溴离子在生物合成中对氯离子有竞争性抑制作用的原理。 据研究四环素与金霉素有一共同的代谢分叉的间体，此中间体进一步的代谢方向取决于不同酶活力的大小，其示意图见（图3－1）
图3－1四环素和金霉素分叉代谢示意图
图3－1中A为四环素和金霉素的代谢分叉中间体，在此之前，四环素和金霉素的代谢途径相同，A物质在E1酶的作用下生成B物质，它进一步代谢即生成四环素（TC）。A物质在有氯离子存在时，在氯化酶E2的作用下生成ACl，然后再在E1酶的作用下生成BCl，再进一步反应即生成金霉素(CTC)。因此，A物质究竟向那个方向代谢，则取决于系统中氯离子与氯化酶存在的多少，所以若把氯化酶的量减少，反应就会较多的向四环素方向进行。现考虑加入溴化物作为竞争性抑制剂，因为氯化酶E2也可以催化溴化物的形成，从而消耗掉一些氯化酶减少金霉素的形成，在反应中也形成了一些溴四环素，但此反应速度较慢，整个反应还是形成较多四环素。此反应中随溴离子量的增加四环素量也有所增加，但随氯离子的增加四环素的量会减少。
上述两个作用都有一定的局限性，第一个措施受硫醇苯骈噻唑毒性的影响，第二个措施受溴四环素的量和氯离子的限制，所以在生成四环素的过程中若用金色链丝菌用作生成菌、在水中又存在氯离子时，常将两个措施一起用，以最大限度地减少金霉素地量。
2
2、化学法测定四环素和金霉素地原理如下：
实验利用比色法测定四环素和金霉素的效价。四环素和金霉素都能在酸性条件下加热生成黄色脱水四环素和脱水金霉素其产生黄色的深浅与它们的含量多少成正比。所以通过反应比色即可知道二者地总含量（预先要做好四环素浓度的标准曲线），称其为总效价。
在碱性条件下，金霉素不稳定，可生成无色的异金霉素，而四环素则比较稳定，然后将其在酸性条件下产生的黄色，比色测出的即为四环素的量。将测出的总效价值减去四环素的效价值即为金霉素的效价。
金霉素 异金霉素
发酵液中，由于杂质的干扰将影响比色的正确性，因此加入乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA）作为螯合剂，掩饰金属离子的干扰，改变四环素脱水条件(降低酸度或延长加热时间)可以减少杂质对比色反应的干扰。
本实验用一支金色链丝菌在加入氯离子、硫醇基苯骈噻唑和溴化钠等物质的作用下看四环素和金霉素的产生量的多少，来验证上述原理和措施。
通过培养基的配制和接种、发酵最后通过化学手段测定四环素和金霉素的效价，本实验因为培养时间较长学生实验可分二次进行。
3
1实验内容：配制种子培养基和四种发酵培养基、接种子、转发酵。放瓶；测
效价；利用比色法测定四环素和金霉素的效价。
2实验材料和仪器：
1、金色链丝菌菌种（由实验室提供）。旋转式摇床：转速230转/分。 2、培养基原材料；
（1）种子培养基配方：花生饼粉 2 ％(20g/L)；淀粉4 ％(40g/L)；酵母粉0.5 ％；蛋白胨0.5 ％；硫酸胺0.3 ％；硫酸镁0.025 %；磷酸二氢钾0.025 %；碳酸钙0.4 %；PH自然。
（2）发酵培养基配方：花生饼粉4 ％(40g/L)；淀粉10 ％；酵母粉0.2 ％；蛋白胨1.4％；硫酸胺0.25 ％；硫酸镁0.25 %；α－淀粉酶0.02 %；碳酸钙0.5 %；pH自然。
EDTA 试剂，取乙二胺四乙酸二钠盐 4.5 克，和NaOH 5.5克溶解于5000ml 蒸馏水中。
固体草酸、乙二胺四醋酸二钠盐（EDTA）混合试剂、4 N盐酸、721分光光度计
3实验步骤：
（1）配种子培养基，配制时淀粉要先糊化。配置100ml , 取30 ml，250ml 三角瓶中八层纱布，外加牛皮纸。
（2）接种：种子培养基消毒后冷却，在无菌室中将金色链丝菌斜面挖一小块放入培养基中然后放在旋转式摇床上28℃培养20小时。
（3）配发酵培养基：先将所需淀粉糊化后冷却至60℃左右，加入α－淀粉酶。在60℃水浴中保温10－20分钟待淀粉液化后在把其它成分放入。 （4）将配好的发酵培养基分成四分分别编号：配置200ml , 分别取4次，每次40 ml，放置250ml 三角瓶中八层纱布，外加牛皮纸。
1＃对照（即为上述培养基） 2＃加入0.3％溴化钠 3＃加入0.3%氯化钾
4