在注射产品有药典方法测量微粒，如美国药典的方法<788>。但是，这种方法只关注10和25微米以上的颗粒。最近，subvisible颗粒受到了极大的关注，无论从管理机构以及该领域的研究人员。人们担心，这可能是在蛋白质产品中发现的微粒的最大免疫原性。此外，新的分析方法，如微血流显像（MFI），不仅可以使人在这个尺寸范围量化颗粒，但也捕捉到单个粒子的图像，从而能够从杂质中区分蛋白质聚集体。
另一方面，
并不是所有的不溶性蛋白质都是由于聚集反应。盐分离蛋白，那就是，增加溶质的排除造成蛋白质的化学电位可能超过固相。虽然我们对蛋白质溶解度的认识仍然是不完善的，在过去20年取得重大进展。盐分离蛋白仍然保留活性和天然性状结构，沉淀是完全可逆的稀释。
表面吸附作用
一种蛋白质在生物加工和最后剂型形成过程中可能接触无数表面，界面稳定是一个不可低估的重要因素。自身吸附是一种物理的不稳定，因为它改变了蛋白质的物理状态。然而，更成问题的是，可以在界面接触产生压力随后发生的损害。蛋白质在水溶液中吸附到已知的各种表面。例如，G - CSF，一个疏水细胞因子和IL- 2已被证明可吸附到玻璃上。对IgG1的结合塑料已被报道和牛血清白蛋白（BSA），像其他蛋白质，显示一些吸附不锈钢的特性。结果，许多生物物理在蛋白质的吸附研究已发表，特别是因为它适用于加工和蛋白质不稳定。
表面诱导蛋白质不稳定始于表面天然吸附或部分展开蛋白; 这种互动是通常更积极有利当一个蛋白局部展开由于他们更多的接触疏水氨基酸侧链，它们通常埋在蛋白质的核心区。经过初始吸附的蛋白质，在（即气液界面，固液界面）的不同界面的表面张力可以驱动通过影响蛋白质分子结构的完整性，填充界面区聚集。在表面与来自表面的部分展开蛋白质解吸相结合的结构摄动可能导致成核现象和聚集物的生成在总体溶液中。因此，蛋白质的界面稳定性被认为是一个关键因素，表面张力，可吸附表面积，蛋白质分子（即疏水性）的表面属性，结构稳定性。
在固体界面蛋白质遭受降解作用的一些类型的报告越来越多。这是特别真实的膜相互作用，蛋白质在其中进行膜聚集和污染。看来，这对在溶液中稳定的蛋白质抑制聚集的相同的方法将适用于膜的损伤作用。这包括提高构象的稳定性，降低蛋白质间相互作用的吸引力，并利用表面活性剂限制的蛋白质表面吸附。
此外，
外国还有一些物理的蛋白质不稳定的主要原因的报告。例如，在PAFase纳米玻璃器皿开口管形瓶除热原期间导致聚集。在灌装过程中，金属粒子可以引进，形成细胞核聚集体形成。不锈钢纳米粒子也可引起聚集反应。多种过滤材料橡胶，玻璃和金属部件导致不稳定在预充式注射器中，包括硅油问题。在上世纪80年代硅油在胰岛素不稳定中被涉及，但很少被赞赏因为是造成的蛋白质不稳定的问题原因。一项关于硅
油对蛋白质聚集体影响的广泛的研究发现，影响需要有高浓度。然而，问题仍然存在。数据表明，硅油可能在一个相对稳定的蛋白质的影响不大，但可能会加速一个已经缺乏免疫或稍微稳定蛋白的聚集。这已被视为一个IgG1硅油存在的地方搅拌加速聚集，但没有搅拌压力，硅油不造成聚合。 气液界面
所有界面损伤，这似乎是一个最大问题。一方面，它是任何产品在生产过程中普遍存在的相互作用。如果最终的成分是一个水成液，对界面损伤机会可能出现在海运和搬运储存过程中的。因此，搅拌的研究是一个液体配方筛选辅料的一个重要方面。 已经有很多对蛋白质药物搅拌方面的研究。这样做的目的如果可以使蛋白质界面足够暴露，允许损害发生。通常在制定方法，以减轻空气水界面损伤是添加表面活性剂（见下文）。搅拌通常是由搅拌或摇晃完成，虽然有时有涡旋出现。例如，猪生长激素（pGH）广泛聚集涡旋观察1分钟以上。添加0.1％的聚山梨酯80防止涡流引起的几乎完全损伤。最近，检查在IgG1的摇动和搅拌的效果。有趣的是，搅拌引起聚集比摇动多。在这两种情况下，添加聚山梨酯20发现在减少界面损伤相当有效。搅拌也能引起睫状神经营养因子的损伤。在这种情况下，增加稳定性观察了添加聚乙二醇3350和丙二醇与吐温20一样。因此，表面活性剂相当旨有效的在减少蛋白质在大多数系统界面损伤。虽然这是20年前确立的良好方法，
我们现在有更多的例子和提供一个更大的表面活性剂的稳定机理的认识。对蛋白质的稳定表面活性剂的详情如下。
总体而言，
表面活性剂在尽量减少界面损伤方面是最有效稳定剂。对其他类别的添加剂在水气界面损伤效应不太清楚。例如，它现在已经知道，越来越多的构象稳定性可以减少损伤发生在一个界面。另一方面，排除溶质的添加，如蔗糖，增加在水气界面的表面张力，从而增加了构象重排的可能性。此外，蔗糖可提高蛋白质的吸附在空气液界面和促进在界面展开。因此，这不是一件简单的内容预测增加排除溶质的影响，如蔗糖，对蛋白质在水溶液界面稳定性。
搅拌和盐效应
研究界面的离子效应，
这些工作同时具有物理稳定性的影响以及离子如何影响的蛋白质溶剂界面。较少人知道关于如离子何影响蛋白质在水气界面的行为。然而，最近已经开始研究这些影响。发现酶在水溶液和泡沫细胞中的气水界面的失活取决于两个气泡表面积的大小和盐的浓度，较高摩尔浓度的甲酸铵，从而增加失活。盐所产生的影响进行了研究，并通过促容剂使酶失活而不是kosmotropes，提供有关Hofmeister效应可能定量机制一些指导。此外，检测搅拌形成压力造成不溶性单抗聚集物形成在盐类存在时。在添加负离子和离子强度离液序列高的发现浊度增加。因此，有越来越多例子证明盐可以同时具有正面以及对界面损伤的有害影响。但是，我们关于这一主题的机
制理解仍然是不完整的。 冰水界面
首先研究在冰水界面损伤出现在20世纪90年代。在许多情况下，添加非离子表面活性剂大大降低损害。蛋白质损伤的程度与冰表面面积相关。从那时起，有很多在冷冻系统界面损伤的报告，包括上面列出的这些。一个值得注意的是，临界胶束浓度（CMC）与温度的关系往往被忽视。细胞介导的细胞溶解在冷却到接近水的冰点可以增加高达5倍多，这意味着可能是在室温下足够量的表面活性剂稳定性在低温下可能不足。 复合冻融循环的不利影响现在已确定。因此，几乎所有的冻融（F - T）的研究现在使用多个（3到10）周期。还应当指出，重要的是要使用相同的降温和升温的方法，这些变化每个变化会影响蛋白质的物理稳定性。即使是蛋白质，通常被认为是高表面活性的IgG等，能在反复冻融循环经历聚合。
减少蛋白质表面损伤
在制药业，
非离子表面活性特别是聚山梨酯20和80（也分别被称为吐温20?和吐温80?）经常添加入蛋白质溶液，以防止或减少在储存，过滤，纯化和运输过程中不必要的吸附和聚集。表面活性剂的能力，尤其是那些非离子的，现在已确定可以减少界面损伤。然而，应该指出的是，非离子表面活性剂的使用可能伴随着相关的不良后果。例如，虽然聚山梨酯80抑制摇动诱导的IL- 2 突变性蛋白聚集，它增加在长期的储存的时
候的蛋白质氧化和聚合。此外，温度的依赖性和表面活性剂与蛋白质相互作用的性质，非离子表面活性剂可以在一个浓度依赖性方法促进溶解体积中蛋白聚集形成。
改善蛋白质稳定性
我们对如何提高蛋白质的稳定性的知识基础比1989年更多了。一些策略及进展是在一些细节在这里已被验证。每个课题都可以成为自己审查的主题。然而，它们在蛋白质不稳定，稳定和组分方面值得的注意。它们包括在水溶液中的构象稳定、胶体不稳定、界面不稳定性、蛋白质干燥、化学改性、定点突变，在水溶液中的构象稳定的不含溶质（渗透剂）
在1989年众所周知的低分子量的添加剂能增加自由能的伸展，基于Timasheff和同事们发表的的许多出版物。可是，这作为一般的制定策略方法的应用，只是在那个时候开始出现。从那时起，排斥溶质构象稳定无数的例子已报道。我们现在知道，渗透剂一般机制，提供增加蛋白质构象稳定。因此，几乎所有的糖醇或应增加蛋白质的结构稳定性。因此，几乎所有的糖或多元醇可以增加蛋白质的结构稳定性。此外，它也表明，大多数氨基酸作为排除的溶质，这样做的还有盐和许多高分子材料，包括明胶，甚至聚羟体。
除了增加蛋白质的构象稳定性，另一个排除溶质的价值是从溶液中盐析出蛋白质。这种做法已被广泛用于酶，然后将其作为硫酸铵沉淀出售。盐析出的蛋白质认为仍然保
留了天然结构和活动。最近，该方法制备天然抗体的高度浓缩的沉淀物。
配体结合稳定天然状态
相反，通过排除溶质提供的稳定，有可能鉴别配体，可以选择性地结合蛋白质的天然状态，通过Wyman连锁功能导致网络稳定，然后由Tanford概念阐述。尽管这一想法在1989年被提出，
当时它并没有被制药科学家广泛认同。因此，值得强调的是已经在过去二十年，这表明许多典型的辅料，包括表面活性剂，缓冲液，高分子材料以及一些金属离子已被报道，它们都可以通过这个机制改善构象稳定。同时，变性状态的优先结合能够使蛋白质的构象不稳定，如Miyawaki 。结果，虽然Wyman连接功能，可以同时解释构象稳定和不稳定的，它可以提供另一种方法以增加蛋白质的结构稳定性。反过来，这导致减少随后贮藏过程中展开和聚集。 缓冲液
使用的缓冲液，以稳定蛋白质常常被认为完全是因为本身的能力来调节pH值的变化。然而，对于许多蛋白质组分，特别是当蛋白浓度相对较高，而不是缓冲液的蛋白质，提供了广大的缓冲能力。此外，缓冲液其他的稳定机制，现已被报道。它们可以作为自由基清除剂，一个事实，可追溯到由Good等人到原来的意见。这些缓冲液常常被称为Good缓冲液。更重要的是，一些缓冲液似乎可以直接与蛋白质结合，从而增加构象稳定。
据报道，磷酸盐赋予一些增加稳定作用。关于这一点一个可能的解释，在与所观察到的某些缓冲区稳定性增加很多，是天然状态的缓冲区的直接的结合。根据Wyman报道，这应该导致网状蛋白质的稳定，只要没有类似的具有结合能力的未折叠状态。在磷酸盐的情况下，高电荷，它的结合位点可能是在α-螺旋N-末端的，其中螺旋偶极偏爱与带负电荷的配体相互作用。报道通过磷酸盐稳定作用。
更多的时候，
稳定作用似乎会出现在氮基缓冲区。一种抗体通过MES柠檬酸缓冲体系的优先稳定作用已被报道。同样，组氨酸已经显示出稳定的单克隆抗体，干扰素-tau和促红细胞生成素。在后一种情况下，Tris缓冲液也有效。此外，一些柠檬酸的稳定作用已被观察到。关于干扰素-α（干扰素-α），柠檬酸比磷酸盐或磷酸盐柠檬酸混合物更稳定。柠檬酸也使抗胰蛋白酶和IL-1受体拮抗剂稳定。
表面活性剂
虽然表面活性剂大部分是稳定蛋白质，通过防护使用和界面损伤，现在已证明，多山醇脂可以结合到特定的蛋白质，如人生长激素。自这些第一次报告以后，发现多三醇酯也可以与融合蛋白结合。还值得一提的是还有报告说多三醇酯不与某些蛋白质结合，尤其是抗体。聚醚F- 107，另一种非离子型表面活性剂，已被发现可与G - CSF结合。离子表面活性剂还结合蛋白质，赋予稳定作用。阴离子表面活性剂与蛋白质结合已有多
项被公布了，包括胰岛素，胰凝乳蛋白酶，牛血清白蛋白和烟草花叶病毒外壳蛋白。在所有这些情况下，蛋白质的天然状态的直接相互作用导致构象稳定。
高分子材料
已经有很阴离子聚合物的报告（其中包括生物大分子如肝素）结合的基本蛋白质，导致了在稳定作用。这已多次被看到的aFGF及bFGF蛋白。在这些蛋白质，有高度正电荷的阴离子聚合物的位点可以结合。阴离子聚合物结合其他的例子（多聚阴离子），增加蛋白质的稳定性已被报道如胰岛素和细胞色素?。 环糊精
环糊精（CD）的是有环的，已知的碗状糖类结合小分子，目前发现多数已获得批准医药产品。结合发生在环糊精相对疏水的内部，允许环糊精呈现外表面的亲水。这样做，疏水性化合物可以溶解。关于蛋白质天然状态的结合，将导致网状构象稳定，从而提高身体稳定性。
根据报道β- CD可以增加人生长激素关于聚合物理稳定性。在这两种情况下，CD被证明结合到一个毫摩尔蛋白质的天然状态结合常数。后一项研究也表明，CD不改善化学稳定性。类似改进稳定的结果，已经存在的CD已在胰岛素中已被报道。另一方面，也有报告CD降低蛋白质的稳定性。此外，还有一些证据表明，CD也无法简单地通过增加稳定构象作为表面活性剂发挥一
定的作用的稳定性。据了解，羟丙基-β- CD的保护猪生长激素搅拌引起的损伤。 金属离子
很多蛋白都包含金属结合位点。即使是一个小的酸性氨基酸簇也可以和金属结合。值得注意的是mmol级的金属结合就能够产生1千焦/mol或者更多的展开自由能。例如，人生长激素能够结合多种二价阳离子，具有四螺旋束的蛋白可以结合金属离子这已经被知道了。另外，高浓度的锌可以导致人生长激素的聚合。
类似的，钙可以明显的提高市售酶的稳定性，如：DNA酶。如蛇毒溶栓酶中包含1mol的锌。这不可能是催化作用，但是这个锌原子是蛋白稳定的必要要求。金属离子，例如钙，是因子VIII的两条多肽链连接必要的。
阴离子结合
阴离子结合使蛋白稳定已经被观测到了。例如，硫酸盐可以结合内皮丁它和核糖核酸酶。核糖核酸酶表现出结合2mol的氯根离子，这可以显著的提高结构的稳定性(～2–3 kJ/mol)。人血清白蛋白的稳定性和结合氯离子和羧化物有关，如甲酸盐和乙酸盐。
离子对蛋白稳定性的作用
向蛋白溶液中添加盐的作用有很多。一些作用是特定的相互作用，例如：上文描述的阳离子或阴离子的直接结合。一些作用是