6、试述凝胶层析、亲和层析、离子交换层析的原理和操作要点。
答：（1）凝胶层析：凝胶层析柱中装有多孔凝胶，当含有各组分的混合溶液流经凝胶层析柱时，各组分在层析柱内同时进行两种运动。①随着溶液流动而进行的垂直向下的移动②无定向的分子扩散运动（布朗运动）。大分子物质由于直径大，不能进入凝胶的微孔，只能分布于凝胶颗粒的间隙中，以较快的速度流过凝胶柱。较小的分子能进入凝胶微孔内，使小分子物质向下移动的速度比大分子的慢，从而使混合液中各组分按照相对分子质量由大到小的顺序先后流出层析柱，达到分离的目的。操作过程一般包括装柱、上柱、洗脱等过程。 （2）亲和层析：原理：亲和层析是利用生物分子与配基之间所具有的的可逆的亲和力，使生物分子分离纯化的层析技术。当酶液流经亲和层析试剂时，酶分子与其配基分子结合留在柱内，而其他杂质不与配基结合，可洗涤流出，然后用适当的洗脱液进行洗脱，达到酶的分离纯化。 方法：分子对亲和层析、免疫亲和层析、共价亲和层析、疏水层析、金属离子亲和层析、染料亲和层析、凝集素亲和层析。
（3）离子交换层析：原理：离子交换层析是用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的的一种层析方法。离子交换剂是含有若干活性基因的不溶性高分子物质，通过在不溶性高分子物质（母体）上引入若干可解离基团（活性基团）而制成。带电量小，亲和力小的先被洗脱下来，带电量多，亲和力大的后被洗脱下来。操作过程一般包括：装柱、上柱、洗脱和收集、再生。 7、简述凝胶电泳的分类及其原理。
答：凝胶电泳是以各种具有网状结构的多孔凝胶作为支持体的电泳技术，凝胶电泳同时具有电泳和分子筛的双重作用，具有很高的分辨率。主要有（琼脂糖凝胶电泳和）聚丙烯酰胺凝胶电泳，分为（1）连续凝胶电泳：只用一层凝胶，采用相同的pH和相同的缓冲液。此法配制凝胶时较为简便，但是分离效果稍差，用于组分较少的样品的分离。（2）不连续凝胶电泳：采用2或3层性质不同的凝胶重叠起来使用，采用2种不同的pH和不同的缓冲液，能使浓度较低的各组分在电泳过程中浓缩成层，从而提高分辨率。（样品胶、浓缩胶pH6.7~6.8、分离胶ph8.8~8.9）（3）梯度凝胶电泳：采用由上而下浓度逐渐升高、孔径逐渐减小的梯度凝胶进行电泳。梯度凝胶用梯度混合装置制成，主要用于测定球蛋白类组分的分子质量。（4）SDS—凝胶电泳：（负电荷）主要用于蛋白质相对分子质量的测定。
8、酶结晶的主要方法有：盐析结晶法、有机溶剂结晶法、透析平衡结晶法、等电点结晶法。
9、*酶的提取分离纯化技术 细胞破碎法 细胞破碎 物理破碎法 化学破碎法 酶促破碎法 提取 沉淀分离 离心分离 非膜过滤 过滤与膜分离 膜分离技术 吸附层析 分配层析 离子交换层析 层析分离 凝胶层析 亲和层析 层析聚焦 电泳分离 萃取分离 结晶 浓缩与干燥 分子对亲和层析、免疫亲和层析、共价亲和层析、疏水层析、金属离子亲和层析、染料亲和层析、凝集素亲和层析 捣碎法、研磨法、匀浆法 温度差破碎法、压力差破碎法、超声波破碎法 添加有机溶剂、添加表面活性剂 自溶法、外加酶制剂法 盐溶液提取、酸溶液提取、碱溶液提取、有机溶剂提取 盐析沉淀法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、复合沉淀法、选择性变性沉淀法 差速离心、密度梯度离心、等密梯度离心 粗滤（常压过滤、加压过滤、减压过滤）、微滤 加压膜分离（微滤、超滤、反渗透）、电场膜分离（电渗析、离子交换膜电渗析）、扩散膜分离 （洗脱方法：溶剂洗脱法、置换洗脱法、前缘洗脱法） 纸上层析、薄层层析 纸电泳、薄层电泳、薄膜电泳、凝胶电泳、等电聚焦电泳 有机溶剂萃取、双水相萃取、超临界萃取（等压、等温和吸附分离）、反胶束萃取 盐析结晶法、有机溶剂结晶法、透析平衡结晶法、等电点结晶法 浓缩、干燥（真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥、气流干燥、吸附干燥） 10、*要纯的：电泳；要量多的：沉淀；要又纯又多的：层析。
11、*常速/低速离心机最大转速8000r/min；高速离心机(1~2.5)*104r/min；超速离心机(2.5~12)*104r/min。 12、*层析分离：是利用混合液中各组分的物理化学性质（分子的大小和形状、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数等）的不同，使各组分以不同比例分布在两相中（固定相和流动相）。当流动相流经固定相是，各组分以不同的速度移动，从而使不同的组分分离纯化。
13、*电泳：带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程。其移动速度主要决定于其本身所带的静电荷量。
14、*不同电泳的应用范围：（1）淀粉板薄层电泳：蛋白质、核酸、酶。（2）薄膜电泳：酶。（3）凝胶电泳：蛋白质。①连续凝胶电泳：组分较少的样品分离；②不连续凝胶电泳：静电荷相同的组分也可以分离；③梯度凝胶电泳：测定球蛋白类组分的分子质量；④SDS-凝胶电泳：蛋白质相对分子质量的测定。（4）等电聚焦电泳：酶的等电点测定及酶和其他蛋白质的分离。
15、*SDS-凝胶电泳：蛋白质溶液中加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原，SDS能使蛋白质分子的氢键、疏水键打开，并与蛋白质分子结合，形成蛋白质-SDS复合物，由于SDS带负电荷，使各种复合物带上了相同密度的负电荷，而掩盖了原来电荷的差别，此外，SDS与蛋白质结合后，引起蛋白石构象的变化，在水溶液中变成长椭圆形，且长轴的长度与相对分子质量成正比，因此，蛋白质-SDS复合物在凝胶电泳轰额迁移率不再受原有电荷和分子形状的影响，至于相对分子质量有关。
16、*反胶束：又称反胶团，是表面活性剂分散于连续有机相中形成的纳米尺度的一种聚集体，反胶束溶液是透明的、热力学稳定的系统。表面活性剂是由极性基团和非极性基团组成的两性分子。
第五章 酶分子修饰
1、试述酶分子修饰的概念和作用。
答：通过各种方法使酶分子的结构发生某些变化，从而改变酶的催化特性的技术过程称为酶分子修饰。通过酶分子修饰，可以使酶分子结构发生某些合理的改变，就有可能提高酶的催化效率、增强酶的稳定性、降低或消除酶的抗原性、改变酶的底物专一性等，同时通过酶分子修饰，研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响，可以进一步探讨其结构与催化特性之间的关系。 2、何谓金属离子置换修饰？简述其主要修饰过程和作用。
答：（1）把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的催化特性发生改变的修饰方法成为金属离子置换修饰。（2）方法：酶的分离纯化、除去原有的金属离子、加入置换离子。（3）作用：①阐明金属离子对酶催化作用的影响；②提高酶的催化效率；③增强酶的稳定性；④改变酶的动力学特性。 3、何谓大分子结合修饰？有何作用？
答：（1）采用水溶性大分子与酶的侧链基团共价结合，使酶分子的空间构象发生改变，从而改变酶的催化特性的方法称为大分子结合修饰。（最广泛）（修饰剂的选择、修饰剂的活化、修饰、分离）（2）作用：①通过修饰提高酶的催化效率；②通过修饰可以增强酶的稳定性；③通过修饰降低或消除酶蛋白的抗原性。 6、简述定点突变技术的主要技术过程及其在酶分子修饰中的应用。
答：定点突变是20世纪80年代发展起来的一种基因操作技术，是指在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的操作技术。定点突变技术是氨基酸置换修饰和核苷酸置换修饰的常用方法，也是蛋白质工程的常用技术。（1）主要过程：①新的酶分子结构的设计；②突变基因碱基序列的确定；③突变基因的获得；③新酶的获得。（2）应用：①酪氨酰-tRNA合成酶的修饰是将第51位的苏氨酸由脯氨酸置换，苏氨酸的密码子是ACU、ACC、ACA、ACG，脯氨酸的密码子是CUU、CCC、CCA、CCG，在mRNA上只需将密码子上的第一个A换成C，在对应的基因上只需将T换成G即可达到置换的目的。②T4溶菌酶的修饰是将第3位以异亮氨酸（密码子为AUU、AUC、AUA，对应基因上的碱基次序为TAA、TAG、TAT）置换成半胱氨酸（密码子为UGU、UGC，对应基因上的碱基次序为ACA、ACG），只需在对应基因的位点上置换两个碱基，由AC置换TA即可。
7、*酶分子的修饰：①金属离子置换修饰；②大分子结合修饰；③侧脸集团修饰：氨基修饰、羧基修饰（碳化二亚胺EDC最普遍，可以在较温和的条件下与酶分子的羧基发生酯化反应，可定量测定酶分子中羧基的
数目）、巯基修饰、胍基修饰、咪唑基修饰、吲哚基修饰、分子内交联修饰；④肽链有限水解修饰；⑤核苷酸链剪切修饰；⑥氨基酸置换修饰：化学修饰法、定点突变技术；⑦核苷酸置换修饰；⑧物理修饰。 8、*酶分子修饰的应用：（1）在酶学研究方面的应用：①酶的活性中心研究；②酶的空间结构研究；③酶的作用机制研究（亲和标记法、差示标记法、氨基酸置换法、核苷酸置换法）。（2）在医药方面的应用：①降低或消除酶抗原性；②增强医药用酶的稳定性。（3）在工业方面的应用：①提高工业用酶的催化效率；②增强工业用酶的稳定性；③改变酶的动力学特性。（4）在抗体酶研究开发方面的应用（抗体酶又称催化性抗体，是一类具有催化功能的抗体）。（5）在核酸类酶人工改造方面的应用。（6）在有机介质酶催化反应中的应用。
第六章 酶、细胞、原生质体固定化
1、举例说明常用的固定化方法。
答：（1）酶的固定化方法：①吸附法（纳米级颗粒，活性炭）；②包埋法（琼脂糖、海藻酸钠）：凝胶包埋法、半透膜包埋法；③结合法（选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方式。）离子键结合法、共价键结合法（重氮法、EDC是一个氨基和羧基在中性条件下有效结合形成肽键、叠氮法、溴化氰法、烷基化法）④交联法（与结合法区别：有两个功能基团）（戊二醛是很重要的交联剂，也是很重要的细胞固定化剂，有两个交联基醛基，两个醛基都可以与酶或者蛋白质的游离氨基反应，形成希夫碱，而使酶或菌体蛋白交联，制成固定化酶或固定化菌体。）（由于交联反应条件较为激烈，酶分子的多个基团被交联，致使酶活力损失较大）⑤热处理法。（2）细胞固定化的方法：①吸附法；②包埋法（动物细胞吸附：微载体是指颗粒细小的固定化载体，中空纤维由聚丙烯、硅化聚碳酸酯等高分子聚合物制成）。（3）原生质体固定化方法：吸附和包埋（常用凝胶包埋法：琼脂-多孔醋酸纤维素固定化法、海藻酸钙凝胶固定化法、角叉菜胶固定化法、光交联树脂固定化法）。（固定化原生质体可用于氨基酸的生产和胞内酶的生产） 2、何谓固定化酶？固定化酶的特性与游离酶比较有哪些改变？
答：固定化酶是指固定在一定载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶。固定化酶既保持了酶的催化特性，又克服了游离酶的不足之处，具有提高酶的催化效率、增加稳定性、可反复或连续使用以及易于和反应产物分开等显著优点。固定化酶的特性：①稳定性：热稳定性提高；保存稳定性提高、保存时间较长；对蛋白酶的抵抗性增强、不易被蛋白酶水解；对变性剂的耐受性提高。②最适温度：有些与游离酶差不多，有些变化较大。③最适pH变化（因为有些基团消失）。④底物特异性（其变化与底物分子质量大小有关）。 3、固定化酶在工业上有何应用？举例说明之。
答：固定化酶的应用：（1）在工业生产中的应用：①氨基酰化酶；②葡萄糖异构酶；③天冬氨酸酶；④青霉素酰化酶（用于制造各种半合成青霉素和头孢菌素）⑤延胡索酸酶；⑥β-半乳糖苷酶；⑦天冬氨酸-β-脱羧酶；⑧脂肪酶；⑨植酸酶。（2）在酶传感器方面的应用：酶电极。 4、何谓固定化细胞？固定化细胞有何特点和应用？
答：固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞称为固定化细胞。通常只能用于胞外酶等胞外产物的生产。（1）固定化微生物细胞：特点：①保持了细胞的完整性和天然状态，可以进行正常的生长繁殖；②保持了细胞内原有的酶系、辅酶体系和代谢调控体系，可以按原来的代谢途径进行新陈代谢，并进行有效的代谢调节控制；③发酵稳定性好，可以反复或连续使用较长时间；④其密度的提高可以提高产率；⑤由于有载体的保护作用，可以提高基因工程菌的质粒稳定性。应用：①利用固定化微生物生产各种产物：酒精酒类、氨基酸、有机酸、酶和辅酶、抗生素、甾体转化、废水处理、有机溶剂、维生素、化工产品生产；②固定化微生物细胞制造微生物传感器。（2）固定化植物细胞：特点：①由于有载体的保护，可减轻剪切力和其他外界因素对植物细胞的影响，提高植物细胞的存活率和稳定性；②细胞经固定化之后，被束缚在一定的空间范围内进行生命活动，不容易聚集成团；③固定化植物细胞发酵可以在不同的培养阶段简便的更换不同的培养液，即首先生长培养基中增殖，在达到一定的细胞密度之后，改换成发酵培养基，以利于生产各种所需的次级代谢产物；④可反复或连续使用较长一段时间，大大缩短生产周期，提高产率；⑤易于与培养液分离，利于产品的分离纯化，提高产品质量。应用：制造人工种子，生产各种色素、香精、药物、酶等次级代谢产物（胞外产物）。（3）固定化动物细胞：特点：①提高细胞存活率；②提高产率；可反复或连续使用；④易于与产物分开，利于产物分离纯化，提高产品质量。应用：主要用于生产各种疫苗、各种激素、酶类、多肽药物及各种组织器官。
5、*酶的一些不足之处（酶固定化的原因）：①酶的催化效率不够高；②酶的稳定性较差；③酶的一次性使用；④产品的分离纯化较困难。
6、*酶固定化的历史：①1953年的货的格鲁布霍费和施莱思采用聚氨基苯乙烯树脂为载体，经重氮化法活化后，制成固定化酶；②1969年，日本的千畑一郎首次在工业生产规模应用固定化氨基酰化酶从DL-氨基酸连续生产L-氨基酸，实现了酶应用史上的一大变革（第一次工业固定化酶）。 7、*在固定化酶的研究制备过程中，起初都是采用提取和分离纯化后的酶进行固定化，随着技术的发展，也可以采用含酶菌体或菌体碎片进行固定化。
第七章 酶非水相催化
1、简述酶非水相催化的概念与特点。
答：酶在非水介质中的催化作用称为酶的非水相催化。酶的非水相催化是通过改变反应介质，影响酶的表面结构和活性中心，从而改进酶的催化特性。主要内容包括有机介质中的酶催化、气相介质中的酶催化、超临界流体介质中的酶催化和离子液介质中的酶催化。 2、酶在有机介质中与在水溶液中的特性有何改变？
答：酶在有机介质中起催化作用时，由于有机溶剂的极性与水有很大差别，对酶的表面结构、活性中心的结合部位和底物性质都会产生一定的影响。在以下方面表现出与水相介质中不同的催化特性：①底物专一性；②对映体选择性；③区域选择性（基因选择性）；④键选择性；⑤热稳定性；⑥pH特性（通常接近或相同）。 3、什么是必需水和水活度？水对非水相中酶的特性有何影响？
答：水对有机介质中酶催化的影响：（1）水对酶分子空间构象的影响：维持酶分子完整的空间构象所必需的最低水量称为必需水。必需水与酶分子的结构和性质有密切关系，是维持酶分子结构中氢键、盐键等副键所必需的。（2）水对酶催化反应速度的影响：在催化反应速度达到最大时的水含量称为最适水含量。（3）水活度：在有机介质体系中，酶的催化活性会随着结合水量的增加而提高。水活度（Aw）是指体系中水的逸度与纯水逸度之比。通常可以用体系中水的蒸汽压与相同条件下纯水的蒸汽压之比表示。采用水活度作为参数来研究有机介质中水对酶催化作用的影响。 4、有机溶剂对酶催化有何影响？
答：有机溶剂对酶催化的影响：（1）有机溶剂对酶结构与功能的影响：在水溶液中酶分子均一的溶解于水中，可以较好的保持器完整的空间结构，在有机溶液中，酶分子（修饰后可溶于有机溶剂的除外）不能直接溶解，悬浮在你溶剂中进行催化反应，包括①有机溶剂对酶分子表面结构的影响；②有机溶剂对酶活性中心结合位点的影响。（降低结合能力）（2）有机溶剂对酶活性的影响：有些极性较强的有机溶剂会夺取酶分子的结合水，影响酶分子微环境的水化层，从而降低酶的催化活性，甚至引起酶的变性失活。（3）有机溶剂对底物和产物的影响：有机溶剂与水的极性不同，在反应过程中会影响底物和产物的分配，从而影响酶的催化反应。 5、如何控制有机介质中酶催化反应的条件？（有机介质中酶催化反应的条件及其控制）
答：①有机介质中酶催化反应的类型：合成反应、转移反应、醇解反应、氨解反应、异构反应、氧化还原反应、裂合反应②酶的选择：注意酶浓度、催化反应速度大小、酶的稳定性、底物专一性、对映体选择性、区域选择性、键选择性③底物的选择和浓度控制④有机溶剂的选择⑤水含量的控制⑥温度控制⑦pH控制。 6、举例说明酶非水相催化的应用。
答：（1）手性药物的拆分：环氧丙醇衍生物的拆分、芳基丙酸衍生物的拆分、苯甘氨酸甲酯的拆分。（2）手性高分子聚合物的制备：可生物降解的聚酯的合成、糖酯的合成。（3）酚树脂的合成。（4）导电有机聚合物的合成。（5）发光有机聚合物的合成。（6）食品添加剂的生产：利用脂肪酶或酯酶的催化作用生产所需的酯类、利用芳香醛脱氢酶生产香兰素。（7）生物柴油的生产：生物柴油是由动植物或微生物油脂与小分子醇类经过酯交换反应而得到的脂肪酸酯类物质。可以采用酸、碱催化油脂与甲醇之间的转脂反应，而生成脂肪酸甲酯。（8）多肽的合成：α胰蛋白酶催化的合成在水溶液中合成率为0.1%以下，在乙酸乙酯和微量水的系统中合成率可达100%。（9）甾体转化。 7、*有机介质反应体系：微水介质体系、与水溶性有机溶剂组成的均一体系、与水不溶性有机溶剂组成的两相或多相体系、正胶束体系、反胶束体系。
第八章 酶定向进化
1、何谓酶定向进化？有何特点？基本过程是什么？
答：（1）酶分子定向进化，是模拟自然进化过程（随机突变和自然选择），在体外进行酶基因的人工随机突变，建立突变基因文库，在人工控制条件的特殊环境下，定向选择得到具有优良催化特性的酶的突变体的技术过程。（2）特点：适应面广、目的性强、效果显著。（3）基本过程： 酶基因 随机突变 构建突变基因文库 筛选 正突变基因 进化酶
反复进行 负突变基因 2、简述易错PCR技术进行体外基因突变的主要过程。
答：易错PCR是从酶的单一基因出发，在改变反应条件的情况下进行聚合酶链式反应，使扩增得到的基因出现碱基配对错误，从而引起基因突变的技术过程。PCR：双链DNA的变性（解链）、引物与单链DNA退火结合、引物延伸。易错PCR在原有基础上提高镁离子的浓度、添加一定浓度的锰离子、改变4种底物的浓度比等反应条件，使DNA聚合酶在催化基因扩增时，增加碱基配对错误的出现频率，而引起基因突变。易错PCR技术所引起的基因突变和遗传进化仅在单一分子内发生，所以属于无性进化。 3、什么叫做DNA重排技术？其主要过程包括哪些步骤？
答：DNA重排技术又称为DNA改组技术，是从正突变基因文库中分离得到的同源DNA，用酶切割成随机片段，经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱基序列重新排布而引起基因突变的技术过程。DNA重排技术将存在于两种或多种不同基因中的正突变结合到一起，通过DNA碱基序列的重新排布，形成新的突变基因，属于有性进化。包括交错延伸PCR技术、随机引物体外重组技术。
两条以上 DNA 突变 构建突变 筛选 正突变基因 进化酶 正突变基因 酶切 随机片段 无引物 基因 基因 基因文库 PCR 重组 负突变基因 酶切 反复进行 4、什么是基因家族重排技术？它与DNA重排技术有何异同？
答：基因家族重排技术又称基因家族改组技术，是从基因家族的若干同源基因出发，用酶切割成随机片段，经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱基序列发生重新排布而引起基因突变的技术过程。与DNA重排技术主要不同点在于前者从基因家族的若干同源基因出发进行DNA序列的重新排布，后者则采用易错PCR等技术获得两个以上正突变基因出发进行DNA序列的重新排布。 5、简述突变基因定向选择的基本过程。 答：
突变基因 基因载体 基因重组 突变基因文库 筛选
目的基因
6、突变基因的高通量筛选技术主要有哪些？各有什么特点？
筛选方法 平板筛选法 荧光筛选法 噬菌体表面展示法 酵母细胞表面展示法
特点 通量大、效率高、简便快速直观、容易控制和调整环境条件（依据透明圈情况进行筛选） 通量大、效率高、直观明确、容易判断、需要克隆报告基因（可以将绿色荧光蛋白的基因作为报告基因） 通量大、效率高、有效基因通过展示进行富集、需要构建外源基因与噬菌体外膜蛋白基因的融合基因 通量大、效率高、有效基因通过细胞表面展示进行富集、需要构建靶蛋白基因与外援蛋白基因的融合基因