C 分子量小
D 可用于相似基因顺序差异性分析 E 可用末端转移酶进行5′端标记
50．通过哪些措施可以提高杂交反应的速度（ ） 55．整个杂交反应主要以下哪些步骤组成（ ） A 预杂交 B 杂交 A 采用大片段探针 B 少量的反应体积 C 高反应温度 D 不断的振摇 E 大量的反应体积
51．关于切口平移法下述正确的是( ) A 可标记线性DNA B 可标记松散螺旋DNA C 可标记超螺旋DNA D 可标记存在缺口的双链DNA E 可标记随机引物
52．以下哪些方法可以用于从凝胶上转移DNA（A 毛细转移 B 真空转移 C 负压转移 D 电泳转移 E 冷冻转移
53．关于随机引物法标记探针下述正确的是( ) A 可标记单链DNA B 可标记双链RNA C 可标记单链RNA
D 比活性高达108cpm／μg DNA以上 E 常经过SephadexG-50纯化才可使用 54．可以采用哪些方法来标记探针（ ） A 杂交标记法 B 切口平移标记法 C 5’-末端的标记 D 3’-末端的标记
E 化学法延长标记
C 洗脱 D 固定 E 转移
56．放射自显影可以被分为（ ） A 直接放射自显影 B 氧化显影 C 封闭显影 D 间接放射自显影 E 固定显影
57．关于电转移下列描述正确的是( ) A 快速、高效 B 需要特殊设备 C 缓冲液用TAE或TBE D 可产生高温 E 常用NC膜作为支持介质 58．预杂交的主要目的是（ ） A 平衡滤膜
B 封闭非特异性杂交的位置 C 提高杂交信号的检测效率 D 便于从滤膜上除去探针
E 清除用于杂交反应检测的显色物质
59.关于非放射性探针标记，下列描述正确的是( )
A 对人体危害小 B 需要特殊设备 C 可长时间使用 D 灵敏度不如放射性探针 E 重新杂交新探比较容易
60．对于改变DNA片段长度的突变，可以由于缺
失或插入产生，或由于限制性酶切位点改变而导致
6
）限制性片段长度改变。可以通过哪些方法检测（ ） A PCR扩增 B RAPD
C Southerm印迹杂交 D Northern印迹杂交 E 以上都不是 1．根据哪三种不同的分类标准可以将杂交分为哪几类？
2．简述反义核酸技术的基本原理及其应用范围 3．试述Northern blot杂交的操作步骤？ 4．什么是肽核酸？并简述其应用？
5．请举例说明杂交技术在临床检验科基因诊断方
61．重组DNA的筛选可用核酸分子杂交的方法，常用于检测DNA的杂交方法有哪些（ ） A 菌落印迹杂交 B Northern印迹杂交 C Western印迹杂交 D 原位杂交 E 斑点杂交
62．关于RNA探针的描述下列正确的是( ) A 可用于随机引物标记 B 特异性高 C 灵敏度高
D 可用非同位素标记法标记 E 不易降解
63．下列哪些可以作为核酸探针使用（ ） A microRNA B 单链DNA C 寡核苷酸 D mRNA E 双链RNA
64．关于核酸探针的描述下列正确的是( ) A 可以是DNA B 可以是RNA C 可用放射性标记 D 可用非放射性标记 E 必须是单链核酸 （三）问答题
面的应用。
6．请叙述杂交探针标记方法的种类。 7．简述直接放射自显影的原理。
7
参考答案
（一） 名词解释
1．原位杂交：是首先应用核酸探针与组织或细胞中的核酸按碱基互补配对原则进行特异性结合形成杂交体，然后应用组织化学或免疫组织化学方法在显微镜下进行细胞内基因定位或基因表达的检测技术。
2．核酸分子杂交技术：单链的核酸分子在合适的条件下，与具有碱基互补序列的异源核酸形成双链杂交体的过程称作核酸分子杂交。利用核酸分子杂交检测靶序列的一类技术称核酸分子杂交技术。 3．探针：是一段单链或双链核苷酸，用放射性核素或非放射性物质标记其末端或全链，可依碱基配对规律与具有互补序列的待测核酸进行杂交，以探测它们的同源程度。这一段标记的核苷酸被称为探针。
4．反向点杂交：是将多种探针固定在同一膜上，同时参与检测的样品DNA又互不干扰，故能一次性筛查出多种不同的序列，而不是像传统的杂交法，一次仅能检测一个未知序列。
5．缺口平移标记法：该法是利用低浓度DNase I在DNA双链上随机切开若干个切口，然后利用E. coli DNA聚合酶I的5’?3’外切酶活性和5’ ?3’聚合酶活性，使DNA链上的核苷酸不断被切除，而带放射性核素标记的dNTP不断地被填入缺口位置，从而形成两条链被均匀标记的高放射活性的探针。
6．随机引物标记法：随机引物是各种可能序列的寡核苷酸混合物，可以人工合成，也可以使用小牛胸腺DNA的DNase I降解物。随机引物在较低的
退火温度下，能与各种单链DNA模板结合。首先使双链DNA分子变性成为单链，然后退火使随机引物结合于两条单链模板上，当反应液中存在的4种dNTP中有一种带放射性核素标记时，在DNA聚合酶催化下合成新的带标记的DNA链。反应结束后经纯化即可得到标记的DNA探针。 7．末端标记法：寡核苷酸探针由于较其他类型的探针短，需要采用末端标记法。该法需要DNA分子的末端带有羟基，而人工合成寡核苷酸的5’端本身即为羟基。其原理是利用多核苷酸激酶将[?-32P] ATP分子上7位磷酸基转移至寡核苷酸链的5’末端，末端标记也可在3’端进行。
8．Southern blot杂交：是研究DNA图谱的基本技术，在遗传诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。Southern印迹杂交的方法是将标本DNA用限制性内切酶消化后，经琼脂糖电泳分离各酶切片段，接着，使酶切片段DNA发生变性并转印到一固相支持物 (通常是硝酸纤维素薄膜或尼龙膜)上，经固定后和标记探针进行杂交。这种方法不仅可以检测DNA样品中是否存在某一特定的基因，而且还可以获得基因片段的大小及酶切位点分布的信息。
9．荧光原位杂交：是一种利用非放射性的荧光信号对原位杂交样本进行检测的技术。它将荧光信号的高灵敏度、安全性，荧光信号的直观性和原位杂交的高准确性结合起来，通过荧光标记的DNA探针与待测样本的DNA进行原位杂交，在荧光显微镜下对荧光信号进行辨别和计数，从而对染色体或基因异常的细胞、组织样本进行检测和诊断，为各种基因相关疾病的分型、预前和预后提供准确的依
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据。
10．菌落杂交：用于重组细菌克隆筛选的固相杂交，称菌落杂交，主要步骤包括：①菌落平板培养；②滤膜灭菌后放到细菌平板上，是菌落粘附到经适当饱和的吸水纸上；③菌斑溶解产生单练的DNA、固定DNA，用
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①根据杂交核酸分子的种类，可以分为DNA与DNA杂交，DNA与RNA杂交，RNA与RNA杂交；②根据杂交探针标记的不同，可以分为同位素杂交和非同位素杂交；③根据杂交介质的不同，可以分为液相杂交、固相杂交和原位杂交；其中固相杂交又可以分为菌落杂交、Southern杂交、Northern杂交、点杂交和狭缝杂交。
2．简述反义核酸技术的基本原理及其应用范围
反义核酸技术是近几年发展起来的一项新的生物技术。它是根据碱基互补的原理，设计出能特异地同相应靶基因结合的RNA或DNA，从而影响靶基因的转录和翻译，以达到调控靶基因表达的目
P标记的探针与菌落进行杂交；④杂
交后，洗脱未结合的探针，将滤膜暴露于X线胶片进行放射自显影；⑤将自显影胶片、滤膜、培养平板相比较，就可以确 定阳性菌落。 （二）选择题 【A型题】
1．A 2．E 3．D 4．B 5．E 6．A 的。反义核酸技术包括反义RNA技术，反义DNA7．C 8．B 9．C 10．B 11．A 12．A
技术及核酶技术。
13．A 14．B 15．A 16．C 17．A 18．A 3 ．试述 Northern blot杂交的操作步骤？ 19．B 20．D 21．A 22．A 23．A 24．A
①RNA的变性琼脂糖电泳；②将硝酸纤维薄
25．C 26．C 27．D 28．D 29．B 30．A 膜放在含有RNA电泳条带的凝胶上；③转印盘中31．E 32．A 33．E 34．D 35．D 的转移缓冲液将逐渐为胶和膜上覆盖的吸水纸吸36．B 37．E 38．B 39．A 40. B 【X型题】 41．ABCD 47．ABD 53．ABCD 59．ABCD
（三）问答题
1．根据哪三种不同的分类标准可以将杂交分为哪几类？
42．ACD 48．ACDE 54．BCD 60．AC
43．BC 49．ABCD 55．ABC 61．ADE
收，从而利用④毛细作用将胶中的变性RNA分子转移到硝酸纤维薄膜上；⑤转印完成后，使RNA44．分子固定到膜上；ACDE 45．⑥膜上的BCD RNA46分子与探针杂交；．ABCD ⑦经放射自显影或其他检测技术显示出杂交区带。
50．BCD 51．ABCD 52．ABD 4．什么是肽核酸？并简述其应用？ 56．AD 57．ABCD 58．AB
肽核酸是一种全新的DNA类似物，在20世纪62．ABCD 63．BCD 64．ABCD 90年代由丹麦科学家发明。肽核酸中以中性的肽链
酰胺2-氨基乙基苷氨酸键取代了DNA中的戊糖磷酸二酯键，其余结构与DNA相似。PNA可以通过碱基互补配对的形式识别并结合DNA或RNA序列，形成稳定的双螺旋结构。由于PNA不带电荷，与DNA和RNA之间不存在静电斥力，因而结合的
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稳定性和特异性都大为提高；PNA与DNA或RNA的杂交能力远远优于DNA、DNA或DNA、RNA杂交，表现在很高的杂交稳定性、优良的特异性，而且不被蛋白酶和核酸酶水解等方面。鉴于上述诸多优点，近年来，PNA被广泛应用在许多高科技领域。如：病原体、遗传病的检测，抗癌、抗病毒反义核酸的研究和应用。特别是PNA可取代核酸用于基因芯片的制备，被认为是基因芯片的升级产品。PNA还可用于定量PCR分析。随着对PNA研究的不断深入，PNA将显示出更大的优越性和更为广阔的应用前景。
5．请举例说明杂交技术在临床检验科基因诊断方面的应用
在临床检验科，杂交技术最常用于基因诊断的例子是镰状细胞贫血病的基因诊断。
镰状细胞贫血是一种单基因遗传性疾病，病因是编码血红蛋白的基因发生点突变导致编码?链第6位的谷氨酸被缬氨酸取代，表示为?6(A 3)谷→缬。在血红蛋白基因的碱基序列上表现为第6位密码子GAA突变为GTA，也就是在这一位点发生了A到T的点突变。由于这一突变导致基因内部一个MstII限制性酶切位点丢失，因而针对这一情况，可以设计与?-珠蛋白基因杂交的核酸探针。先扩增靶片断，并用MstII消化扩增的DNA片断，电泳分离消化的DNA片断。将DNA片断转印到硝酸纤维素薄膜上，采用Southern杂交技术检测DNA片断。以此将正常人、携带者和患者区分开来。
此外, 还可以用凝血因子Ⅸ基因探针检测B型血友病，凝血因子ⅩⅢ基因探针检测A型血友病，用胰岛素基因探针检测糖尿病，用苯丙氨酸羟化酶
基因探针检测苯丙酮尿症。以上都是杂交技术在临床检验科进行基因诊断的例子。 6．请叙述杂交探针标记方法的种类
探针的标记方法可分为放射性核素标记法和非放射性核素标记法两大类。
(1) 放射性核素标记的探针，灵敏度高、特异性强，主要缺点是容易造成放射性污染，而且放射性核素的半衰期较短，必须随用随标。
标记手段主要有：缺口平移法、随机引物合成法和末端标记法。
(2)非放射性核素标记法：非放射性核素标记法无放射性污染，探针标记后可保存较长时间(2年以上)，但灵敏度和特异性尚不如核素标记。常用的标记物有生物素、地高辛配基和辣根过氧化物酶。标记手段类似于放射性核素标记。
①生物素标记探针：生物素(biotin)是一种水溶性维生素，可与dUTP的C－5位共价结合，用其标记的dUTP可代替dTTP掺入DNA探针。这种标记探针能与抗生物素蛋白(avidin)特异结合，而抗生物素蛋白上结合的碱性磷酸酶可使反应中的底物显色，从而指示出探针所在位置。
②地高辛配基标记探针：地高辛配基(digoxigenin)可与dUTP共价结合，用其标记的dUTP也可代替dTTP掺入DNA探针，可用与酶或荧光色素结合的抗地高辛配基抗体直接检测，或间接使用免疫荧光法进行检测。
③辣根过氧化物酶标记探针：首先将辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)与带正电荷的聚乙烯亚胺(polyethylene imine)交联结合，然后由这种带正电荷的复合物与带负电荷的单链或双链DNA结
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合，在戊二醛稀溶液作用下，HRP与DNA形成共价键，产生酶标记探针。杂交后利用酶促反应使底物显色即可指示探针位置。该法是利用化学反应直接将酶连接在核酸上，而不需要将酶先连接于dNTP再掺入DNA分子，因此更为简便。 7．简述直接放射自显影的原理
直接放射自显影是在暗室巾将含放射性杂化分子的滤膜与X胶片紧密的贴在一起，放入不透光的盒子，同位素衰减会释放β射线感光胶片上的银颗粒，产生稳定的潜影，胶片经冲洗后产生可见的图像。图像的位置与胶片上杂化分子的位置一致，图像的深浅反应了杂化分子的含量。X线胶片常常为弹性塑料片，在其两面均覆盖了照相感光乳胶和白明胶，白明胶覆盖在照相感光乳胶的外层以防止其被刮脱。32P、35S、14C元素放射的β射线会穿透X线胶片，少部分作用于X线胶片的照相感光乳胶。
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