第24卷第6期Vol．24，No．6
DOI：10．11686/cyxb2014312
草业学报
ACTAPRATACULTURAESINICA2015年6月June，2015
http：//cyxb．lzu．edu．cn
2015，24（6）：99-107．杨晓丹，原现军，郭刚，崔棹茗，李君风，白晰，巴桑，邵涛．西藏豆科牧草青贮饲料中耐低温优良乳酸菌的筛选．草业学报，YangXD，YuanXJ，GuoG，CuiZM，LiJF，BaiX，BaS，ShaoT．Isolationandidentificationoflowtemperature-tolerantlacticacidbacteriafromlegumesilagesinTibet．ActaPrataculturaeSinica，2015，24（6）：99-107．
西藏豆科牧草青贮饲料中耐低温优良乳酸菌的筛选
111，211131*
原现军，郭刚，崔棹茗，李君风，白晰，巴桑，邵涛杨晓丹，
（1．南京农业大学，饲草调制加工与贮藏研究所，江苏南京210095；2．山西农业大学动物科学技术学院，山西太谷030801；
3．西藏日喀则地区草原工作站，西藏日喀则857000）
鉴定，以期得到优良的乳酸菌菌株。以苜蓿和箭摘要：本研究对西藏地区豆科牧草青贮饲料中的乳酸菌进行分离、
3株筈豌豆青贮饲料为试验材料，共分离得到6株同型发酵乳酸菌，经传统微生物培养和16SrRNA序列分析，（LCG9，CG35和AG11）为戊糖片球菌，2株（LCG3和LAG1）为植物乳杆菌，1株（LA3）为弯曲乳杆菌；除AG11和LAG1在5℃，LCG9和AG11在pH3．0和8．0生长微弱外，pH3．0～8．0及3．0%和其余乳酸菌菌株均在5～20℃，6．5%NaCl培养液中生长良好。从耐低温特性、产酸能力和发酵速率3个指标考虑，植物乳杆菌LCG3最适宜用于西藏青贮饲料生产的乳酸菌菌种。
关键词：豆科牧草；青贮饲料；乳酸菌；分离；鉴定
*
Isolationandidentificationoflowtemperature-tolerantlacticacidbacteriafrom
legumesilagesinTibet
2
YANGXiao-Dan1，YUANXian-Jun1，GUOGang1，，CUIZhao-Ming1，LIJun-Feng1，BAIXi1，BASang3，SHAO
Tao1*
1．InstituteofEnsilingandProcessingofGrass，NanjingAgriculturalUniversity，Nanjing210095，China；2．CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu030801，China；3．ThePrairieWorkstationofShigatse，Tibet，Rikze857000，China
Abstract：Theobjectivesofthisstudyweretoidentifylacticacidbacteriawithdesirableattributesbyisolatingandiden-tifyinglacticacidbacteria（LAB）fromlegumesilagesinTibetanPlateau．Atotalof6homofermentiativelacticacidbac-teriawereisolatedfromalfalfa（Medicagosativa）andcommonvetch（Viciasativa）silage．StrainsLCG9，CG35andAG11wereidentifiedasPediococcuspentosaceus，strainsLCG3andLAG1asLactobacillusplantarumandstrainLA3asLactobacilluscurvatu．Conventionalmicrobialidentificationmethodsand16SrRNAsequencinganalyseswereusedtoi-dentifydifferentstrains．Theselectedstrainsweregrowninarangeofconditions；temperature5－20℃，pH3．0－8．0andNaCl3．0%and6．5%．LCG9andAG11grewweaklyat5℃whileLCG9andAG11wereinactiveatpH3．0andpH8．0．LCG3wasidentifiedasthebeststraintouseasasilageadditiveinTibetduetoitsuniquetoleranceoflowtem-perature，highlacticacidproductionandrapidreproductiverate．
Keywords：Legumegrass；silage；lacticacidbacteria；isolation；identification
西藏自治区是我国五大牧区之一，畜牧业是西藏农业经济的主导产业。但是青藏高原平均海拔高达4000
*
07-14；改回日期：2014-10-21收稿日期：2014-EW-STS-071），），“十二五”基金项目：中国科学院科技服务网络计划（STS计划）（KFJ-国家科技支撑国家星火计划项目课题（2013GA840003计划（2011BAC09B03）和农业部成果转化项目（2013GB2F40046）资助。
mail：yxd695114957@163．com），在读硕士。E-女，河南洛阳人，作者简介：杨晓丹（1990-*通讯作者Correspondingauthor．E-mail：taoshaolan@163．com
100
草业学报第24卷
m，自然气候条件恶劣，寒冷季节长达7～9个月，导致牧草生长期短，季节性饲草不平衡，畜牧业生产陷入“夏肥、秋壮、冬瘦、春死”的恶性循环。为了满足牧区反刍家畜冬春季节对饲草料的需求，将农区富余的牧草及农作物秸秆调制成优质青贮饲料是解决牧区畜牧业发展困境的有效途径之一
［1-3］
。
［4］
青贮原料中乳酸菌的种类、数量及活性是影响青贮饲料发酵品质的重要因素，早期的研究发现在西藏青
贮饲料生产中，添加商品乳酸菌制剂未能有效地改善青贮饲料的发酵品质，可能是由于商品乳酸菌制剂适宜生长温度在30℃左右，难以适应西藏高海拔、低温和缺氧的极端气候条件，其性能发挥受到了限制。因此发掘和利用青藏高原特有的本土乳酸菌种质资源，发挥其适应性强的特性，对于该地区优质青贮饲料的生产，促进畜牧业的发展具有重要意义。
近年来，国内外有关牧草中附着乳酸菌或青贮饲料中乳酸菌的收集、分离、鉴定及其在青贮饲料生产中的应用备受关注。大部分研究结果表明
［5-10］
，青贮饲料中分离得到的优良乳酸菌均能明显改善青贮发酵品质；部分异
［2］
型乳酸菌还能抑制青贮饲料有氧暴露期间的腐败变质，提高其有氧稳定性。有关研究报道国青藏高原地区存在着适应于极端环境的特殊乳酸菌种质资源。
，在我国高海拔、低
温和缺氧的极端环境中进行牧草青贮时能够得到优质青贮饲料，几乎没有有氧腐败现象发生，由此可以推测在我
紫花苜蓿（Medicagosativa）和箭筈豌豆（Viciasativa）是西藏主要的栽培豆科牧草，具有适应性强、适口性好、蛋白质含量及营养价值高等特点，经常与禾本科牧草以混合青贮方式生产青贮饲料。本研究旨在从西藏豆科牧草青贮饲料中分离生物学特性优良的乳酸菌菌株，从而为西藏青贮饲料添加剂的研发和应用奠定基础。11．1
材料与方法样品采集
紫花苜蓿和箭筈豌豆种植于西藏日喀则地区草原工作站试验田（平均海拔3836m，北纬29°16'，东经88°51'）；该地区属于高山亚寒带半干旱季风气候，气温6．3℃，日照时数3233h。紫花年均降雨量为422．4mm，苜蓿和箭筈豌豆均处于结荚期，于2013年9月28日刈割，刈割后在田间用铡刀切成2cm左右，装填至实验室青45d时开窖取样，贮窖中压实密封，置于室温条件下保存，分别在青贮第5天，对青贮饲料中乳酸菌进行分离鉴定。紫花苜蓿和箭筈豌豆青贮5和45d各5个重复，共计20个青贮窖；实验室青贮窖，为容积2L的圆柱状塑料容器，有内外两层盖，便于密封保存。1．2
培养基，试剂及主要仪器设备
［6］
葡萄糖酵母蛋白胨（GYP）培养基和MRS培养基参考Cai等的方法配制，营养琼脂培养基，虎红琼脂培养
基购自南京寿德试验器材有限公司。
APICHL培养基和API50CH试剂条购自法国BioMerieux公司，DNA提取试剂盒购自北京天根生物科技有PCR合成引物由上海英潍捷基生物科技有限公司合成。限公司，
PCR仪、主要仪器设备：恒温培养箱、超净工作台、光学显微镜（OLMPUS）、立式压力蒸汽灭菌器、超低温冰U-2910）、pH计（HANNApH211型）。箱、凝胶成像仪、电泳仪、紫外分光光度计（日立，1．3
原材料的微生物成分分析
采用平板培养方法进行微生物计数，在超净工作台中采用四分法取原材料样品10g，放入90mL的无菌生理盐水密封，置于常温摇床上摇动2h。用无菌生理盐水适当稀释，取3个适宜梯度涂板，每个梯度2个平行。乳酸菌选用MRS培养基，好氧菌选用营养琼脂培养基，霉菌和酵母菌选用虎红琼脂培养基，置于35℃恒温培养箱中培养2～3d计数。1．4
乳酸菌的分离与纯化
分别取青贮5和45d后的青贮饲料同上述步骤进行稀释，选用GYP培养基进行乳酸菌的分离培养，挑选具35℃2～3d，有黄色透明环的菌株分离，在MRS固体培养基上划线培养，重复划线分离培养3次，得到纯化的单菌株。然后根据菌落的颜色、大小、光泽、形状等选取典型菌株进行革兰氏染色，油镜镜检，过氧化氢酶试验；凡是革兰氏染色阳性、过氧化氢酶阴性的菌株初步认定为乳酸菌菌株
［2］
，在MRS液体培养基中富集（35℃24h）后加
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－20℃保存，入等体积40%的甘油，分装，备用。1．51．5．1
乳酸菌的生理生化特性检测不同温度水平生长试验
将配制好的MRS培养液以每试管5mL的量分装好，在121℃高压条件下灭
10，15和菌15min，将待测菌株培养液，以相同的接种量（0．1mL）接入培养液中摇匀，塞子封口，分别置于5，20℃恒温培养箱中培养，其中5和10℃培养5～7d，其余培养3～5d，观察菌株的生长情况。1．5．2
不同pH和盐浓度水平生长试验
3．5，4．0，4．5，5．0，用盐酸或氢氧化钠将MRS培养液pH调至3．0，
7．5和8．0等7个水平，用分析纯NaCl将MRS培养液的盐浓度调至3．0%和6．5%两个水平，同上述步骤，将待测菌株培养液以相同的接种量（0．1mL）接入已灭菌培养液中，置于35℃恒温培养箱培养2d后，观察试验菌株的耐酸碱能力。1．5．31．6
糖发酵试验
使用包含49种不同碳水化合物和一个对照的API50CHL进行不同糖，醇发酵鉴定，在
35℃条件下培养48h后测定发酵结果。具体方法按照试剂盒的说明进行。
乳酸菌菌株的16SrRNA序列测定
13000r/min离心10min，取30℃条件下培养12h的培养液各1mL，沉淀物用于DNA提取，具体的操作方法AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和严格按照试剂盒说明进行。PCR选用细菌16SrRNAV3区通用引物：27f（5'-1492r（5'-TACCTTGTTACGACT-3'）。PCR反应体系包括：2×PCRMasterMix25μL，DNA模板1引物各2μL，94℃，5min；变性，94℃，30s；退火，55℃，30s；延伸，72℃延伸1ddH2O20μL。PCR反应程序为：预变性，μL，
min，共35个循环。PCR纯化产物送样测序（上海英潍捷基生物科技有限公司）。
用BLAST将所测定菌株的16SrRNA序列与GenBank/EMBL/DDBJ数据库中已知细菌的16SrRNA序列进行比对，寻找与目的基因序列同源性最高的已知分类地位的菌种，分析相似性。然后用MEGA6．0中的ClustalW对最近类群的序列进行多重比较分析，并通过该软件的邻近法（neighborjoining）构建系统发育树，分支聚类的稳定性用Bootstrap方法进行2000次随机重复取样评价1．7
优良乳酸菌菌株的筛选与确定
于35℃恒温培养箱中培养48h；每将分离并鉴定的菌株以3%的接种量接入已灭菌的MRS液体培养基中，
pH值为纵坐标，隔4h取1次样品，测定培养液的pH值，以培养时间为横坐标，绘制生长曲线；用培养液做空白，以培养时间为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制生长曲线。在波长600nm下测定样品的吸光度值（OD值），22．1
结果与分析微生物计数
试验用紫花苜蓿和箭筈豌豆原材料中微生物成分
3
如表1所示。乳酸菌的数量较少，均为10cfu/gFW，4
霉菌数量为10cfu/gFW；箭筈豌豆中好氧菌的数量7
多于紫花苜蓿，达到3．2×10cfu/gFW，但酵母数量3低于紫花苜蓿，只有3．0×10cfu/gFW。
［2］
。
表1Table1
苜蓿和箭筈豌豆微生物分析Microbiologicalanalysisofalfalfaandcommonvetch
微生物计数Countsofviablemicroorganisms（cfu/gFW）
青贮材料Samples
乳酸菌Lacticacidbacteria
好氧菌Aerobicbacteria
霉菌Mold
酵母Yeast
2．2乳酸菌的分离
挑选GYP培养基上具有黄色溶菌环的菌株分离，
箭筈豌豆Commonvetch紫花苜蓿Alfalfa
5．1×1036．7×103
3．2×1075．0×1043．0×1031．1×1062．0×1043．6×105
初步分离出86株乳酸菌菌株进行革兰氏染色、镜检、过氧化氢酶试验、通过不同温度、不同pH和耐盐性试验的比较，分离得到24株耐低温、低pH的乳酸
cfu：Colonyformingunit；FW：鲜重Freshweight．
再对其进行生长产酸试验，共得到6株生长迅速、产酸快的优良乳酸菌菌株。菌株来源如表2所示：苜蓿菌菌株，
青贮饲料共分离得到3株乳酸菌菌株，早期分离得到AG11，晚期分离得到LAG1和LA3；CG35来自发酵5d箭筈LCG3和LCG9分离于发酵45d的箭筈豌豆青贮饲料。豌豆青贮饲料，
102
草业学报
表2Table2
青贮饲料Silagesample苜蓿Alfalfa
第24卷
青贮饲料中分离的乳酸菌菌株
2．3乳酸菌的生理生化特性
乳酸菌的表型特征及生理特点如表3所示。6株
Isolatedlacticacidbacteriafromsilage
发酵时间Ensilingtime（d）
545
菌株名称StrainnameAG11LAG1，LA3CG35LCG9LCG3，
乳酸菌菌株均为革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性、同型发CG35和AG11为乳酸球菌；酵乳酸菌，其中LCG9，LAG1，LA3和LCG3为乳酸杆菌。AG11和LAG1在5℃生长微弱，10～20℃生长旺盛；其余乳酸菌菌株均能在5～20℃范围内表现出很强的生长活力。不同pH值和盐浓度条件下的生长情况为：除LCG9和AG11在pH3．0，pH8．0条件下生长微弱外，其余乳酸3．5，4．0，4．5，5．0，7．5和菌菌株均能在pH值为3．0，
8．0内生长；所有乳酸菌菌株在3．0%和6．5%NaCl条件下生长旺盛，表明分离出的乳酸菌菌株具有耐低温、耐酸碱和强的耐盐特性。
乳酸菌菌株的糖发酵试验结果如表4所示：6株D-D-乳酸菌菌株均能利用核糖，半乳糖，葡萄糖，果糖，D-N-甘露糖，乙酰-葡萄糖胺，熊果苷，七叶灵，麦芽糖和海藻糖产酸。除LA3外，其余乳酸菌菌株均可利用L-阿拉伯糖，苦杏仁甙，纤维二糖和龙胆二糖，微弱利用葡萄糖酸盐。从利用D-松二糖和山梨醇的情况来LAG1，LCG3和LA3可以利用其发酵产酸，看，但LCG9，CG35和AG11不能；除此之外，LAG1和LCG3D-能够发酵甘露醇，α-甲基-甘露糖苷，水杨苷，乳糖，蜜二糖，蔗糖，松三糖和D-棉籽糖，而其余乳酸菌菌株不能。2．4
分离乳酸菌菌株的16SrRNA基因序列分析结合图1系统进化树和表5分离乳酸菌菌株的16SrRNA序列分析结果可知：LCG9，CG35和AG11与戊糖片球菌（Pediococcuspentosaceus）的进化亲缘度均LA3与弯曲乳杆菌（Lactobacilluscurvatus）为为100%，
97%，100%，与对应标准菌序列相似性分别为100%，100%和99．9%；因此，LCG9、CG35和AG11被准确地LA3为弯曲乳杆菌。LAG1和鉴定为戊糖片球菌，
LCG3与植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）和戊糖乳杆菌（Pediococcuspentosaceu）处于同一族群，进化亲缘度达到100%，并具有99．9%的序列相似性，故只通过16SrRNA序列比较，无法确
KJ806309，KJ806295，KJ809299和KJ806306。2．5
分离的乳酸菌菌株的产酸及生长特性
箭筈豌豆Commonvetch
545
表3
Table3
青贮饲料中分离出的乳酸菌的特性
Characteristicsoflacticacidbacteriafromsilage
LCG9球菌
CG35球菌
AG11球菌
LAG1杆菌
LCG3杆菌
LA3杆菌
特性Characteristics菌形状Shape
CoccusCoccusCoccusBacillusBacillusBacillus
发酵类型Fermentationtype革兰氏染色Gramstain过氧化氢酶促Catalase葡萄糖产气Gasfromglucose5℃10℃15℃20℃pH3．0pH3．5pH4．0pH4．5pH5．0pH7．5pH8．03．0%NaCl6．5%NaCl
++++W+++++W++
+++++++++++++
W+++W+++++W++
W++++++++++++
+++++++++++++
+++++++++++++
－
－
－
－
－
－
－
－
－
－
－
－
+
+
+
+
+
+
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
Homo
：“+”，“－”；“W”注阳性阴性弱阳性。
Note：“+”positive，“－”negative，“W”weaklypositive．
CG35，AG11，LAG1，LCG3和LA3在基因库中的登录号分别为：KJ806296，KJ806305，定他们的种族。LCG9，
LAG1和LCG3的产酸速率最快，分离乳酸菌菌株的产酸速率曲线如图2所示，它们在0～8h产酸迅速，8～12h逐渐变缓，12h以后趋于平稳。其中LCG3早期产酸最快，培养12h后，培养液pH降至3．9；16h之后与
第6期杨晓丹等：西藏豆科牧草青贮饲料中耐低温优良乳酸菌的筛选103
LAG1表现出相似的产酸速率。LCG9，CG35，AG11和LA3在整个发酵过程中培养液pH值保持持续缓慢的下降3．83（CG35），3．91（AG11）和3．95（LA3），pH值均达到4趋势，在发酵结束48h时分别达到最低值3．82（LCG9），以下，同样具备较强的产酸能力。
表4
Table4
特性Characteristics
赤藓糖醇ErythritolarabinoseD-阿拉伯糖D-L-arabinose阿拉伯糖L-核糖Ribose半乳糖GalactoseD-glucose葡萄糖D-D-fructose果糖D-D-mannose甘露糖D-甘露醇Mannitol山梨醇Sorbitol
D-methyl-D-mannosideα-甲基-甘露糖苷α-N-acetylglucosamine乙酰-葡萄糖胺N-苦杏仁甙Amygdalin熊果苷Arbutin七叶灵Esculin水杨苷Salicin纤维二糖Cellobiose麦芽糖Maltose乳糖Lactose蜜二糖Melibiose蔗糖Saccharose海藻糖Trehalose松三糖MelezitoseD-raffinose棉籽糖D-龙胆二糖GentiobioseD-turanose松二糖D-葡糖酸盐Gluconate
，“++”，“－”，“W”：“+”生长良好不生长微弱生长。注生长
Note：“+”growth，“++”growthwell，“－”non-growth，“W”growthweakly．
分离出乳酸菌的糖发酵特性
Sugarfermentationprofilesoflacticacidbacteriafromsilage
LCG9－－++++++++++++－－－+++++++++++++－－－++－－+－W
CG35－－++++++++++++－－－++++++++－++++－－－++－－+－W
AG11－－+++++++++++－－－+++++++++++++－－－++－－+－W
LAG1W－+++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++W
LCG3－－++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++W
LA3－－－++++++++++－++－++－+++++－++－－－++－－－++－
不同菌株的生长速率曲线见图3，分离乳酸菌菌株的生长特性均为对数生长曲线；LCG3和LAG1在发酵过2～8h生长速度达到最快，8～10h开始进入稳定期，程中没有明显的迟滞期，培养0～2h开始进入对数生长期，16hOD值分别达到2．512和2．382；在整个培养过程中，LCG3的生长速度最快，这一结果与产酸速率结果基本CG35，AG11和LA3生长速率较缓慢，20h后一致。LCG9，早期培养迟缓期长，但后期培养基中细胞浓度较高，OD值分别为2．203（LCG9），2．185（CG35），2．114（AG11）和2．185（LA3），也表现出良好的生长特性。3
讨论
乳酸菌数量和活性是抑制不良微生物生长和减少发酵损失的一个重要因素，发酵品质取决于青贮材料上初始乳酸菌数量和底物含量
［8］
［9］
。但自然条件下，难以植物本身附着的乳酸菌数量较低，而且主要为异型乳酸菌，