（1）样品可溶性蛋白含量测定：取20μl提取液（酶液）加入80μl，0.05M，pH7.8磷酸缓冲液（即稀释成0.1ml提取液），再加入2.9ml考马斯亮蓝溶液，反应2min后测OD595（以100μl缓冲液加2.9ml考马斯亮蓝为对照调零）。
（2）蛋白质含量计算：
可溶性蛋白质含量（mg/g）=(C×VT)/(W×VS×1000)
C为标准曲线查得的蛋白质含量（μg）；VT为提取液总体积（稀释后的体积ml）；VS为测定时所用提取液体积（ml，20μl）；W为样品鲜重（g）。
过氧化氢（H2O2）含量的测定
一、试剂配制：
1、0.2 mol/L HClO4：取10.05g HClO4溶解于0.5L的水中； 2、4 mol/L KOH：取112 g KOH溶解于0.5L的水中； 3、0.1 mol/L，pH 6.5的磷酸缓冲液：Na2HPO4·12H2O5.6407g+NaH2PO4·2H2O5.3433g用去离子水定容到500ml；
4、显色液：100mL、0.1 mol/L、pH 6.5的磷酸缓冲液+25 μL N,N-二甲基苯胺+10 mg 4-氨基氨替吡啉； 5、过氧化物酶溶液（250 U/mL） 二、测定步骤：
称取植株根和叶片组织各0.5g，分别置于研钵中，加入1.6 mL预冷至4℃的0.2 mol/L HClO4，冰浴匀浆，于10 000×g离心5 min（4℃），取上清液，加4 mol/L KOH调pH值为7.5后，再于10 000×g离心5 min（4℃），取上清液1 mL，加0.4 mL显色液和0.1mL过氧化物酶溶液（250 U/mL），用岛津UV-1601分光光度计测定波长550 nm（可见）处光密度值的变化，H2O2含量以μmol/gFW表示。（用什么调零？） 三、计算方法：（要做标线？）
参考：过氧化氢（H2O2）含量的测定参照Uchida等(2002)方法并加以改进。
还原型谷胱苷肽GSH
2． 试剂配制
（1）1mM GSH标准液10mL（现用现配）：称3.0733mgGSH,加蒸馏水至10mL。(不要) （2）5％磺基水杨酸500mL：25g溶于500mL水中。
（3）6mM DTNB：称取0.118905g DTNB溶于50mL PBS（0.1M，pH7.5）中。 （4）2mM NADPH：18.1mg NADPH溶于10mL PBS中。
（5）1mMGSSG标准液10mL：6.126mg GSSG加PBS至10mL。(不要) 实际配置
0.1M PBS(pH 7.5): 3个处理*2个品种*3次重复*0.5ml*3次测定=27ml; （实际配置50 ml）
6mM DTNB: 3个处理*2个品种*3次重复*0.2ml*3次测定=10.8ml; （实际配置50 ml，实际用量0.1189g） 2mM NADPH: 3个处理*2个品种*3次重复*0.1ml*3次测定=5.4ml;（实际配置50 ml, 实际用量18.1mg） (1U)GRⅢ: 3个处理*2个品种*3次重复*0.1ml*3次测定=5.4ml; （实际配置50 ml, 实际用量10ml） 5％磺基水杨酸：3个处理*2个品种*3次重复*0.01ml*3次测定=0.54ml;（实际配置10ml）(实际用量0.5g/10ml)
0.5mM PBS: 3个处理*2个品种*3次重复*1.5ml*3次测定=81ml; （实际配置100 ml）
乙醚（二乙醚）: 3个处理*2个品种*3次重复*10ml*3次测定=540ml; （实际配置1000 ml）
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PBS Buffer 0.5mM: 3个处理*2个品种*3次重复*1.5ml*3次测定=81ml; （实际配置150 ml） 2-乙烯吡啶: 3个处理*2个品种*3次重复*0.2ml*3次测定=10.8ml; （实际用量20 ml） 乙醚: 3个处理*2个品种*3次重复*10ml*3次测定=540ml; （实际用量1000 ml） 1．标线制作：
配制浓度为0，0.02mM,0.04mM,0.06mM,0.08mM,0.1mM,0.12mM的标准GSH溶液（吸取上述标准液各0.1mL）加入0.5mL 0.1M磷酸钠Buffer（pH7.5）(含5mM EDTA)，0.2mL 6mM DTNB,0.1mL 2mM NADPH,0.1mL(1U)GRⅢ（谷胱甘肽还原酶）(sigma),从0.1mL GSH启动反应，测定650s的A412（OD412），绘制标准曲线。以PBS代替DTNB作空白。
3． GSH（还原型谷胱甘肽）及GSSH（氧化型谷胱甘肽）
（1）取1g新鲜叶片，加入10μL（可以取0.2g鲜样，加1.6ml提取液）5％磺基水杨酸，研磨后在14000g离心10分钟，取1mL上清液，加入1.5mL,0.5mM PBS （pH7.5）中，再用5mL乙醚（二乙醚）抽取二次（杂质会融到乙醚层中，而乙醚处于整个反应体系得上层，你直接用枪吸取上层乙醚丢弃即可，反复进行两次即为抽取两次），此提取液用于分析总谷胱苷肽含量。 各取1mL上清液，加入1.5mL PBS Buffer 0.5mM (pH7.5),0.2mL 2-乙烯吡啶（原装试剂浓度）混合至乳胶状，在25℃反应1小时，再用5mL乙醚（原装试剂浓度）抽提2次，此提取液用于分析GSSG『GSSG－氧化型谷胱甘肽， GSH－还原型谷胱甘肽不能够直接测出，需测出氧化型和还原型谷胱甘肽含量，即总的谷胱甘肽含量，然后减去氧化型谷胱甘肽(GSSG）含量得到还原型谷胱甘肽含量（GSH）） （2）取反应混合液（0.5mL 0.1M PBS(pH 7.5)(内含5mM EDTA)，0.2mL 6mM DTNB，0.1mL 2mM NADPH,0.1mL(1U)GRⅢ（sigma），由加入0.1ml提取液开始反应，测OD412，在25℃下，反应650s（大约十分钟），分别计算总谷胱苷肽及GSH含量。以不加DTNB，加相应剂量的PBS作空白。
GR（谷胱苷肽还原酶）测定
一、 试剂配置
50mM PBS（K）（pH 7.0，含0.2mmol EDTA,与APX的相同）：K2HPO4·3H2O 6.9607g+KH2PO4 2.6538g混合后定容到1L；然后加入292.25×0.2=58.45gEDTA;
10mM GSSG（用水配）：612.63×10×0.001=6.126g溶于1L水中; 2.4mM NADPH（用PBS配）：833.4×2.4×0.001=2.0g溶于1L水中. 实际配置
50mM PBS（K）: 3个处理*2个品种*3次重复*1.7ml*3次测定=91.8ml; （实际配置150 ml, 实际用量58.45g*0.15=8.7675g）
10mM GSSG: 3个处理*2个品种*3次重复*0.1ml*3次测定=5.4ml; （实际配置50 ml, 实际用量6.126g*0.05=0.3063g）
2.4mM NADPH: 3个处理*2个品种*3次重复*0.1ml*3次测定=5.4ml; （实际配置50 ml, 实际用量2.0g*0.05=0.1g） 二、测定步骤
用3mL比色杯，依次加入1700μL 50mM PBS（K）（pH 7.8，含0.2mmol EDTA），100μL 10mmol GSSG，100μL 2.4mmol NADPH，100μL 酶液（叶绿体悬浮液，与APX相同）启动反应，25℃，以NADPH启动发应（指最后加NADPH），测定OD340，1min变化值，吸光系数2.8mM-1cm-1，不加NADPH为对照（调
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零）。
四、计算方法：
△OD/△t×Vr×VT A×d×Vt×W
△OD为反应时间内吸光度的变化（60秒吸光度－0秒吸光度）；△t为反应时间（60秒）；Vr为反应
液体积（2mL）；VT提取液体积（叶绿体稀释后的体积）；A为消光系数（2.8mM-1.cm-1）；d为比色杯厚度（1cm）；Vt测定液体积（0.1mL）；W为样品鲜重（叶绿体质量）。
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