广东海洋大学硕士学位论文
1前言
1.1马氏珠母贝的研究现状
1.1.1马氏珠母贝的概述
马氏珠母贝（Pinctada martensii），也称合浦珠母贝，属软体动物门，瓣鳃纲，珍珠贝目，珍珠贝科，珠母贝属，是目前我国培育海水珍珠的主要贝类之一。马氏珠母贝是暖水性贝类，在中国主要分布在南海海区，广东大亚湾、流沙湾海区和广西北海都是重要的养殖区。1965年张玺教授带领研究团队在广西首次进行马氏珠母贝的人工育苗并取得成功，开启了人工养殖培育珍珠的时代[1]。1970年湛江水产学院成立珍珠研究小组，在熊大仁教授的领导下对珍珠养殖和加工工艺进行研究[2]，研究成果不断在生产中推广应用，生产规模不断扩大，马氏珠母贝珍珠产业迅速发展，于上世纪90年代达到产业高峰，养殖面积近30万亩，年产珍珠20万吨左右，未加工的初级产品产值超过2亿元。南珠因珍珠品质优良而闻名世界。然而，近几年马氏珠母贝的养殖规模不断缩小，马氏珠母贝珍珠质量与产量明显下降，马氏珠母贝珍珠产业陷入了低谷。
影响南珠产业衰退的因素中，马氏珠贝种质退化是一个不可忽视的原因。随着人类活动对海洋环境影响的加剧，马氏珠母贝的野生群体变得越来越小，同时，由于生产一线人员在苗种培育方面缺乏基本的育种理论，造成长期近交衰退，另外，科研人员引种进行杂交育种或从杂交后代中进行选择育种时，造成品种混杂。直接造成马氏珠母贝生长速度慢，抗逆性差，珍珠质分泌能力差，进而造成养殖周期长和珍珠品质差的严重后果。因此，进行马氏珠母贝种质复壮和通过遗传育种技术培养出具有优良经济性状的良种是振兴南珠产业的重要举措。
马氏珠母贝的遗传育种跟其他水产经济动物的育种相似，主要是杂交育种、多倍体育种、选择育种和近年来发展较快的分子标记辅助育种等。杂交育种可以增加群体的遗传多样性，同时也增加了更多的变异，而根据育种目标进行选择育种可以进一步强化目标性状的出现概率；马氏珠母贝多倍体育种早有研究[3-7]，但在理论和生产实践上还存在诸多问题，马氏珠母贝多倍体育种的理论和方法有待突破。目前分子标记辅助育种在马氏珠母贝的遗传育种中已有应用，随着技术的发展，有望缩短马氏珠母贝良种培育的进程。马氏珠母贝的遗传育种不应该局限于某种育种手段，任何有助于良种培育的方法都可以为科研工作者所用，马氏珠母贝的良种应该具有生长速度快，抗逆性强，珍珠质分泌旺盛的特点。 1.1.2马氏珠母贝珍珠质矿化的研究
在宏观水平上，对于珍珠质矿化的研究主要体现在：生长性状与珍珠矿化能力相关性的研究。Wada博士研究发现，珍珠的重量与贝壳的重量成正相关[8]，而王庆恒
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马氏珠母贝育珠和生长性状与相关基因的关联分析
等[9]研究表明，壳长、壳高、壳宽、壳重和总重5个生长性状与珍珠的质量和珍珠层厚度存在极显著相关性，提出改良育珠贝的生长性状而达到提高珍珠质量的观点。
马氏珠母贝矿化，尤其是珍珠层的矿化，在分子水平的研究较为深入。首先是贝壳的结构和组成，贝壳由里及外一般分三层，珍珠层、棱柱层和角质层，贝壳由95%的碳酸钙和5%的基质蛋白组成，因此，贝壳基质蛋白一直是学者们关注的焦点，特别是与珍珠层矿化相关的基因或者蛋白质。麻彩萍等[10]从珍珠层中分离和纯化基质蛋白P14；张岑[11]从珍珠层分离纯化得到与珍珠层形成相关的蛋白p10，通过体外碳酸钙结晶实验证明p10能加速碳酸钙以文石晶型结晶；Chihiro Nogawa等[12]研究发现N16具有多样性，至少有两个N16的基因，都能转录和翻译生成N16蛋白质，并参与珍珠质的形成，对N16转录调控机制和功能将更加深入的了解它在软体动物生物矿化的作用；Yu Jiao等[13]克隆得到皮连蛋白（DPT）基因的cDNA全长，RNA干扰实验表明，贝壳与棱柱层接连处的珍珠层的结构发生了紊乱，初步证明DPT与珍珠层生成有关；还有Nacrein[14] ，MSI60[15]等也参与了珍珠层的形成。棱柱层矿化相关基因的研究也有报道，研究发现prismalin-14[16] 、aspein [17]、MSI7 [18]、prisilkin-39 [19]、KRMP家族[20]、prismin 家族[21]等参与棱柱层的形成。Shematrin家族蛋白被证明参与珍珠层和棱柱层的形成[22]。人工养殖游离珍珠的灵感自来于天然珍珠，珍珠贝的外套膜外内侧上皮有分泌珍珠质的机能，在异常情况下，如外界沙粒、寄生虫等入侵刺激，或病理影响，表皮细胞陷入结缔组织中，形成珍珠囊，分泌珍珠质。
对珍珠囊矿化的研究将有助于解开生物矿化的机理，研究发现珍珠囊形成之后首先矿化附着在珠核上的是方解石结晶，然后在此基础上不断分泌，粘附珍珠质。部分基因既能参与珍珠层的形成也能参与与棱柱层的形成，但是对于它们在参与方解石和文石结晶之间的选择调控机制还不清楚。Nariaki Inoue等[23]对生产优质珍珠与劣质珍珠的马氏珠母贝育珠贝外套膜组织中贝壳基质蛋白基因的表达模式比较，认为劣质珍珠是由于棱柱层矿化相关基因的表达量上升导致的，但是由于实验样本数过少，实验结果并不一定是可靠的。珍珠囊是分泌珍珠质的特殊结构，目前对珍珠囊矿化基因表达模式的研究还比较少，值得深入研究。
目前，马氏珠母贝在转录组和基因组上也有研究。赵晓霞[24]对珍珠囊转录组的高通量测序，数据组装和注释后通过数据库比对得到了103条与生物矿化相关的序列，通过对珍珠囊六个不同发育时期矿化相关基因的表达分析，发现了13个差异表达的基因，它们分别编码皮连蛋白、钙调素蛋白和氨酸蛋白酶等；Dong Fang等[25]在马氏珠母贝幼虫贝壳形成的关键点构建三个抑制消减杂交文库，总共2923条EST序列得到990未知基因，从中筛选分泌蛋白和有串联排列重复单元的蛋白，得到一些参与贝壳形成的基因序列，对其中5种文石结晶相关基因RT-PCR和原位杂交的研究表明，这些基因与已知生物矿化相关基因有不同的表达模式。通过RNA干扰抑制5个基因的表达会造成对珍珠层不同的影响，说明这5个基因都参与文石结晶；TAKESHI
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Takeuchi等[26]通过现代高能量测序技术研究了合浦珠母贝的基因组，构建了解开珍珠矿化分子机制的平台。 1.1.3马氏珠母贝生长的研究
马氏珠母贝的生长速度直接影响着珍珠生产的周期，并且普遍认为生长速度快的马氏珠母贝具有更强的珍珠质分泌能力，所以生长速度快是遗传育种的重要目标性状。多年来国内外许多专家学者对马氏珠母贝的生长做了大量的研究，文献报道显示，国外学者Wada 等最早对马氏珠母贝的生长进行研究[27-30]，而国内对马氏珠母贝生长的研究主要有：
（1）对不同地理群体生长性状的比较分析。王爱民等[31]研究马氏珠母贝三个不同地理群体自繁和群体杂交子一代11个形态性状并对性状进行相关分析，认为马氏珠母贝壳长、壳重和总体重是生长速度的重要形态指标；随后王爱民等[32]采用2×2双列杂交的方式，取得马氏珠母贝印度群体和三亚群体4组子代，其中以三亚野生群体作为母本，印度养殖群体作为父本的杂交后代在壳长，壳高，绞合线长等表现出最大的杂交优势，微卫星标记研究表明本杂交子一代杂合度和遗传多样性更高，这是杂交子一代具有明显杂交优势的分子基础；而邹烈星[33]把印度群体和三亚群体双列杂交得到四个后代群体分别在海南陵水和三亚两个地方养殖，试验表明杂交群体生长速度比自交后代快。
（2）通过选择育种对马氏珠母贝生长的研究。何毛贤等[34]从大亚湾海区3月龄马氏珠母贝养殖群体中挑选出大个体和小个体两组，在相同的环境中养殖13个月，定期测量，比较两组个体的生长情况，结果显示初始值较大的个体在后期仍有较大的长速，个别较小的个体生长速度较快，在后期也能长得很大，3-9月龄贝大小增长率较11-16龄快，而体重增长却小于11-16月龄贝；何毛贤等[35]把大亚湾养殖群体选育子一代当作实验组，以大亚湾养殖群体作为对照组，在相同的环境下养殖，并对两组群体生长性状进行1年的跟踪测量，结果显示，实验组壳长、壳高、壳宽、总生和成活率都大于对照组，为马氏珠母良种选育奠定了基础；何毛贤等[36]用一年多的时间跟踪测量马氏珠母贝不同时期的壳长、壳高、壳宽和总重，结果表明，4个性状两两间的相关系数均达到了极显著水平，不同生长时期，活体质量对壳高的偏回归系数极显著差异，确定壳高和总重为育种的目标性状；随后何毛贤等[37]采用单对配对方法建立7个家系，以壳高和总重为选育的目标性状，对家系生长的变异进行比较，确定壳高和总重具有明显优势的家系，该家系作为进一步选育出生长速度更快群体的基础选育材料。还有类似的研究，陈丹群等[38]以连续2代群体选育的马氏珠母贝为亲本，采用单个配对，建立10个合浦珠母贝家系，对生长性状进行研究，选出总体生长指标较好的家系，作为进一步选育的材料；而李雷斌等[39]则通过研究不同规格亲本对子后代生产性能的影响，结果表明大规格亲贝群交后代表现出更加明显的生长优势，截断选择策略有效。
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（3）构建壳色群体研究马氏珠母贝的生长优势。在实际的生产中发现马氏珠母贝的壳色具有多样性，所占比例最大的是白色、黑色、红色和黄色四种壳色，这是一个非常直观的表型性状，能不断选育得到了较纯的壳色群体，并且通过选育不断纯化稳定与壳色关联的性状。自2003年以来，广东海洋大学科技工作者们相继建立起了马氏珠母贝黄色、白色、黑色和红色壳系，并对这四种壳色群体的生长进行了研究。邓岳文等[40]比较了黄色选系F1与同海区同龄养殖群体的形态性状，结果显示，养殖群体平均壳长显著大于黄壳色群体，而黄壳色群体的壳重量指数和肥满度指数显著大于养殖群体；王庆恒等[41]对4个壳色选系F1幼虫生长的比较，显示在幼虫阶段壳色与生长性状可能存在一定的关联性；陈静等[42]比较4种壳色F3与普通群体的生长情况，结果表明F3选系四个性状显著大于普通群体，选系中黑壳色群体生长最快，其次是白壳色和黄壳色，最后是红壳色；朱晓闻等[43]比较4种壳色F5与对照群体的生长情况，4个选系的生长指标均显著大于对照组；郭华阳等[44]以4种壳色选育群体为亲贝，同一壳色雌雄单个配对，构建15个全同胞家系，对幼体生长性状的相关性和遗传力进行分析，结果表明，以壳长和壳高为目标性状进行选育能达到改良生长性状的目的。壳色与其他性状的关联性有待进一步研究。
在微观方面，随着现代测序技术及生物信息学的发展，近年来贝类转录组已经有报道，Huan 等[45]对文蛤不同发育阶段幼虫进行454高通量测序，通过组装拼接并进行功能注释得到一系列与生长发育、免疫和贝壳形成相关的侯选基因，初步分析一些基因在幼虫不同发育阶段的表达情况；Hou 等[46]分析虾夷扇贝成体不同组织和不同发育阶段的转录组特征，序列组装拼得到将获得25237 个蛋白编码基因，通过功能注释获得许多与生长、抗逆性、免疫等相关的基因，同时鉴别了2700 个 SSR 标记和49000 个 SNP 标记；董迎辉[47]从泥蚶转录组数据中挖掘了大量生长相关的基因，如表皮生长因子（EGF）、胰岛素样生长因子（IGF）、转化生长因子 β（TGF-β）和成纤维生长因子（FGF）等；从转录组文库中还发现了细胞外信号调节激酶1/2（ERK1_2）、MAPK激酶1（MEK1）和MKK7等一系列关键酶，以及生长因子受体FGFR、EGFR与受体调节因子蛋白激酶C也被发现。对于马氏珠母贝转录组的研究已有很多报道方，王爱民[48]构建了9个马氏珠母贝的cDNA文库，测序后组装得到大量的EST序列，将得到的EST序列与线虫的生长相关基因比对，得到了175条马氏珠母贝可能与生长相关的基因，但是并没有深入地研究这些基因；Yu Shi等[49]从同一个选育群体中取出5个小个体和5个大个体，通过高通量测序，把得到的EST序列进行比对，34个差异表达的基因中有11个与生长相关，并通过荧光定量检测这些基因在大小群体中的表达。目前马氏珠母贝生长相关基因的研究还相对较少，有待深入研究。
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1.2研究的目的和意义
本实验通过研究马氏珠母贝生长和育珠性状与相关基因的关联性，探索马氏珠母贝育珠和生长性状差异的分子机理，为分子辅助育种应用于马氏珠母贝的品种改良，培育出具有生长速度快和育珠性状好的优良品种提供支持。
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