7、电击，1,5KV.
8、立即加入1ml冰浴的sorbital，静止10min。 9、取100ul转化液，涂布10cm的MD平板。
做了一点修改每块板子大概能长100来个菌落（一般需要2天左右）：
1、菌液收集时间：以前可能是OD值测得不太准确，我然后把菌液分别做了1、2、4、8、16倍稀释，看其OD值是否呈线性关系。1、菌液测OD值时，建议将菌液稀释不同浓度测定，这样才准确些。菌液看上去浑浊，但OD值不高，很可能就是你的OD稀释倍数不够！你分别稀释2倍、4倍、8倍、10倍等，每个倍数做3－5个重复，应该可以大致推断OD值是否准确！
2、我开始是先挑单克隆于5mlYPD中，过夜16h后，转接于50ml YPD中，培养大概18个小时吧。OD值是否测准可以这样估算：OD600为40左右时，菌体湿重（6000rpm离心5min）约0.95g/10ml。高密度发酵时菌体湿重将相应下降。[测OD，用什么作空白对照呢？菌体稀释液，我一般使用PBS]
3、电击条件等上面帖子上都有，1.5kv，放电4.8～5.5ms。
2、其它做法相同，就是感受态做好后，最后一次吸出sorbital时，不是直接倒调的，而是用毛细管轻吸出来的，这样可能使剩下的感受态纯净些。
3、最后用毛细管取出100ul出来，加入质粒，混匀！（我以前怕量不够，吸得很多，电转时效果反而不好。 ）
4、MD板子提前几天做好，放在冰箱里，涂板的时候吸收效果会好些。如果是新板子，可能吸收不是太好，板子上有些积层，反而不利于生长。
5、你说的YNB，我用的是成品，只需要直接配制。42度水浴一会，然后过滤除菌。我没有加硫酸铵。YNB是加到培养基里面的，去离子水pH偏低哦，我建议直接用蒸馏水就可以了（关系不是太大）。
方法三：简便独特
在筛选高表达菌种中，与大多数人和说明书有区别(成功做出几个基因):
每次转化前，均用多种酶BlgII/salI/sacI同时切，转化时，用GS115/KM71/KM71H同时转化，转化的条件也和大家一样，即1.5/25/200,但是我用的是0.1的杯子，不是0.2的，转化后涂MM及YPD+0.25G，长出菌落后，即进行大规模的表达试验，直接用YPD表达的，一般48h后即进行大量的SDS-PAGE鉴定，鉴定时，样品不用浓缩，直接上样，看到目的带后再做PCR，测序。
方法四：没有转化子（无aa的YNB和硫酸铵称好后，去离子水溶解，然后高压灭菌） 1.挑取酵母单菌落，接种至含有50ml YPD培养基的三角瓶中，30℃、250-300rpm培养过夜约14h，OD600约1.3
2.菌液离心5min－50ml冰水洗涤－25ml冰水洗涤－2ml sorbital洗涤，然后溶解于200ul
冰sorbital；两管分装，每管100ul
3.加入约5～10ug的线性化的DNA20ul，枪吹匀，置0.2CM电转杯冰浴5min； 4.电击，1,5KV.使用的是 Eppendorf 2510，用于转化细菌及酵母。 5.立即加入1ml冰浴的sorbital，静止1h。
将菌体悬液涂布于MD平板上，每300μl涂布一块平板；
方法五: 和Invitrogen公司说明书差不多的方法
X33菌株于100ml YPD摇到OD600约1.1-1.3，太高影响感受态效率
(1) 1500－1700g离心5min，将离心管倒置在吸水纸上轻轻控几下，充分弃上清 (2) 加入100ml 冰浴的超纯水ddH2O，可在振荡器上振荡混匀，可静置3－5分钟 (3) 离心，弃上清，再加100ml ddH2O洗一遍 (4) 离心，弃上清，加20ml 冰浴1M Sorbitol洗一遍
(5) 离心，弃上清，菌体置于冰浴中，加入约100－200ul Sorbitol混匀
加入Sorbitol量需自己调整，这时菌液很浓，只要能够用200ul黄枪头吸出来就可以了，一般共有约400－500ul，够做几管感受态了。
(7) 吸取100－150ul感受态到线性化的DNA中，用枪头打匀或手指弹匀
静置5min，于2mm电转化杯中，电击参数：1.5KV，25uF，200欧姆（不是400），一般放电时间在4.5-4.9ms之间，小于4说明你的DNA盐浓度太高
(9) 立即加入1ml Sorbitol，转入10ml 离心管，30度静置1小时，然后加入1ml YPD，30度，200rpm摇1小时，取50－200ul菌液涂100ul/ml YPDS板
(10) 一般转化效率可以达到：200个以上转化子每200ul菌液，足够筛选表达菌株了。
方法六:酵母感受态细胞的制备
⑴ 接种Pichia pastoris GS115于5 ml YPD液体培养基，30℃，250~300250 rpm ，过夜。 ⑵ 取200μl的培养物接种至含有500ml新鲜培养基的三角摇瓶中，28~30℃、250~300r/min培养过夜，一般12小时左右。
⑶ 将细胞培养物于4℃，5000g离心5min，用500ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬； ⑷ 按步骤3离心，用250ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；
⑸ 按步骤3离心，用20ml的冰预冷的1M的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；
⑹ 按步骤3离心，用1ml的冰预冷的1M的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为2ml； ⑺ NOTE：可将其分装为200μl一份的包装冷冻起来，但如果保存时间过长会影响其转化效率。
化学转化
毕氏酵母氯化锂转化法 试剂
1. 1M LiCl：用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌；必要时用消毒去离子水稀释
2. 50% PEG3350 ：Sigma P3640 用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌，用较紧的盖子的瓶子分装
3. 2mg/ml salmon sperm DNA / TE（10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA）-20℃保存 注：醋酸锂对毕氏酵母无效，仅氯化锂有效；PEG3350可屏蔽高浓度LiCl的毒害作用；
毕氏酵母的转化
1. 煮沸1ml鲑鱼精DNA 5min，迅速冰浴以制备单链担体DNA； 2. 将感受态酵母菌离心，以Tips去除残余的LiCl溶液； 3. 对于每一个转化，按以下顺序加入： 50% PEG3350 240ul 1M LiCl 36ul
2mg/ml 单链Salmon sperm DNA 25ul 5～10ug/50ul H2O 质粒DNA 50ul
4. 剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀（约1min）； 5. 30℃水浴孵育30min； 6. 42℃水浴热休克20～25min; 7. 6000～8000rpm离心收集酵母菌体；
8. 重悬酵母于1ml YPD培养基，30℃摇床孵育；
9. 1～4h后，取25～100ul菌液铺选择性培养基平板，于30℃培养2～3天鉴定（将表达菌株和对照菌株在固体培养基平板，30'c培养至转化子出现）
毕氏酵母PEG1000转化法 试剂
缓冲液A：1.0M Sorbitol，10mM Bicine，pH8.35（sigma）,3%（v/v）ethylene glycol 缓冲液B：40%（w/v）PEG1000（sigma），0.2M Bicine，pH8.35 缓冲液C：0.15M NaCl，10mM Bicine，pH8.35 未污染的新鲜、试剂级DMSO，-70℃保存
注：1. 缓冲液A、B、C均用滤膜过滤，-20℃保存;
2. 将DNA直接加在冻结的酵母细胞上是本实验的关键之处（即使在冰上解冻的待转化细胞，其摄取外源DNA的能力也在解冻过程中迅速下降；如进行多样品的转化，建议按6样品/组
进行）;
待转化毕氏酵母的制备
1. 接种环接种Pachia pastoris于YPD平板，30℃培养2d; 2. 挑取单克隆酵母菌株于10mlYPD培养基中，30℃振荡培养过夜；
3. 取步骤2中小量菌液接种到100mlYPD培养基中振荡培养，待其OD值从0.1升到0.5～0.8；
4. 室温下3000g离心收集酵母菌体，50ml缓冲液A洗涤一次；
5. 重悬菌体于4ml缓冲液A中，按0.2ml/管分装于1.5ml的离心管中，每管加入11ulDMSO，混合后迅速于液氮中冷冻， 6. -70℃保存
毕氏酵母的转化
1. 将约50ug线性化质粒DNA溶于20ul TE或水中，直接加于冻结的酵母细胞中；加入担体DNA（40ug变性超声线性化鲑鱼精DNA）以获得最大转化率； 2. 37℃水浴孵育5min，中间混合样品1～2次； 3. 取出离心管，加入1.5ml缓冲液B，彻底混匀； 4. 30℃水浴孵育1h；
5. 室温下2000g离心10min，去除上清液，菌体沉淀重悬于1.5ml缓冲液C中； 6. 离心样品，去除上清液，轻微操作将样品重悬于0.2ml缓冲液C中； 7. 将所有转化液铺于选择性平板，于30℃孵育3～4天后，鉴定；
毕赤酵母转化方法有4 种 。最常用的是电转化法和原生质体法,其中电转化法最为方便,转化效率最高,最容易产生多拷贝整合。由于原生质体法必须首先制备去除细胞壁的原生质体细胞以利于DNA 进入,然后细胞再生细胞壁,产生转化体,而ZeocinR 抑制细胞壁的形成,导致不能产生转化体。因此利用ZeocinR 作为选择标记的载体如p PICZ 系列,不能使用原生质体法进行转化。