实验七 赤霉素 3的生物鉴定
（水稻幼苗第二叶叶鞘伸长的“点滴法”）
实验目的
学习并掌握利用水稻幼苗第二叶叶鞘伸长的“点滴法”测定赤霉素3)的方法，了解赤
霉素对叶鞘伸长的作用
实验原理
赤霉素能刺激幼嫩禾本科植株的节间伸长。将GA3 点滴于水稻胚芽鞘与第一叶之间，在一定的浓度范围内，第二叶叶鞘的伸长与赤霉素浓度的对数成正比。通过测定第二叶叶鞘伸长来进行赤霉素含量的生物测定。
器材与试剂
1. 实验仪器 光照培养室、移液管, 洗耳球, 高压灭菌锅, 小镊子, 刻度尺, 移液枪
2. 实验试剂 饱和漂白粉溶液, 琼脂, 500μmol/LGA3 母液（称取8.6mgGA3 (GA3 相对分子质量:346.38)溶于少量无水或95%乙醇中，再用水湿稀释至50ml；用蒸馏水稀释母液配制0.1、1、10、100μmol/L的标准溶液） 3. 实验材料 水稻种子
实验步骤
1. 水稻灭菌30min（饱和漂白粉溶液）, 自来水冲洗。将种子置于垫有滤纸的培养皿
中, 加水淹没种子,在30℃培养箱中黑暗萌发2d, 此时大部分种子开始露白。 2. 配制0.9%的琼脂, 高压灭菌, 倒入直径9cm的培养皿中。
3. 选取芽长2mm左右的种子, 胚芽朝上且偏于一侧排放在培养皿中的琼脂上, 每皿30粒。在30℃、光强5000-10000lx的培养箱或培养室中, 连续光照培养, 注意保持湿度。 4. 2d后, 选取刚伸出第二叶叶尖的幼苗（苗长0.9-1.0cm ) 。用微量移液器将1μL不同浓度的GA3 标准溶液分别小心滴于幼苗的偏于一侧的胚芽鞘与第一叶叶腋间与第一叶
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之间, 主意要使小液滴正好停留在胚芽鞘与第一叶之间，不使滑落, 如小液滴滑落, 立即拔除这株幼苗。
5．幼苗继续培养3d后, 测定第二叶叶鞘长度
6. 以GA3 标准浓度的对数与叶鞘长度绘制标准曲线, 可以看到在一定浓度范围内, 第二叶叶鞘的伸长与GA3 浓度的对数成比例。
将待测溶液处理后测得的叶鞘伸长数值, 在标准曲线上查得其相应的GA3浓度, 即算得样品中GA3 含量。
注意事项：
1. 用GA3 处理幼苗时, 一定要使液滴停留于胚芽鞘和叶腋间。 2. GA3 母液的配制要精确, 稀释也要准确。
作业：
1、 绘制GA3 标准浓度的对数与叶鞘长度绘制标准曲线。 2、 分别采用小麦和水稻为实验材料，比较和分析实验结果。
实验八 植物体内丙二醛含量的测定
实验目的：
熟悉测定丙二醛（MDA）含量的常用方法
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实验原理：
植物器官在逆境条件下或衰老时, 往往发生膜脂过氧化作用, 丙二醛是其产物之一, 通常将其作为脂质过氧化指标, 用于表示细胞膜脂过氧化程度和植物对逆境条件反应的强弱。 在酸性和高温的条件下, 丙二醛可与硫代巴比妥酸(TBA)在酸性条件下加热与组织中的丙二醛产生显色反应，生成红棕色的三甲川（3、5、5－三甲基恶唑2、4－二酮），三甲川最大的吸收波长在532nm。但是测定植物组织中丙二醛(MDA)时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与硫代巴比妥酸显色反应产物的最大吸收波长在450nm处，在532nm处也有吸收。
植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中丙二醛与硫代巴比妥酸反应产物含量时一定要排除可溶性糖的干扰。
低浓度的铁离子能显著增加硫代巴比妥酸与蔗糖或丙二醛显色反应物在532、450nm处的吸光度值，所以在蔗糖、丙二醛与硫代巴比妥酸显色反应中需要有一定的铁离子，通常植物组 织中铁离子的含量为100～300μg·g·DW，根据植物样品量和提取液的体积，加入Fe
＋
－1
-1
-1
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的终浓度为0.5nmol· L 。在532nm和450nm波长处测定吸光度值，即可计算出丙二醛
含量。
器材与试剂：
1. 实验仪器 分光光度计, 离心机, 研磨器, 恒温水浴, 具塞试管，电炉。
2. 实验试剂 10%三氯乙酸, 石英砂,硫代巴比妥酸（TBA）溶液（用10%TCA配置0.6%的TBA溶液）
3. 实验材料 植物叶片。
实验步骤：
1. MDA的提取 冬天寒流刺激，植物为抵抗严寒，丙二醛含量会增加，取叶片1g将其剪碎, 加入10%三氯乙酸（TCA）2ml和少量石英砂，研磨；进一步加入8mLTCA充分研磨, 匀浆液以4000×g离心10min, 上清液即为样品提取液。
2. 显色反应及测定 吸取2mL提取液, 加入2mL0.6%TBA液, 混匀,在试管上加盖塞, 置于沸水浴中沸煮15min, 迅速冷却, 离心。取上清液测定532nm和450nm下的OD值。对照管以2mL水代替提取液。
3. 计算 MDA与TBA反应产物的最大吸收峰在532nm，TBA与可溶性糖（以蔗糖为例）的反应产物的最大吸收峰在450nm，吸收曲线彼此又有重叠。
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根据Lambert-Beer定律, 最大吸收光谱峰不同的两个组分的混合液, 它们的浓度C与OD值之间有如下关系
OD1 = Ca·εa1 + Cb·εb1 OD2 = Ca·εa2 + Cb·εb2
式中: OD1 为组分a和组分b在波长λ1 时光密度值之和; OD2 为组分a和组分b在波长λ2 时光密度值之和; Ca 为组分a的浓度 Cb 为组分b的浓度
εa1、εb1分别为组分a、b在波长λ1 处的摩尔吸收系数。
同理, 组分a、b在波长λ2 处的摩尔吸收系数分别为εa2、εb2。
已知蔗糖与TBA反应产物在450nm和532nm的摩尔吸收系数分别为85.40、7.40； MDA与TBA显色反应产物在450nm波长下无吸收, 吸收系数为0, 于532nm波长下的摩尔吸收系数为155000。据
OD450 = C1×85.4 OD532 = C1×7.4+155000×C2
求解方程得:
C1=0.01171×OD450
C2=6.45×10×OD 532 -0.56×10×OD450
式中: C1 为可溶性糖与TBA反应产物的浓度，单位是mol/L; C2 为MDA与TBA反应产物的浓度，单位是mol/L。
-6
-6
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根据公式 C2, 然后再计算每克样品中丙二醛的含量μmol C2/100)
作业：
1、 计算植物叶片丙二醛的含量。
2、 分别采用两种不同植物叶片（菠菜和小麦）为实验材料，比较和分析两者的结果。
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