本科学生综合性实验报告
学号： 114120146 姓 名： 段霞飞 学院： 生命科学学院 专业、班级：11级生物科学C班 实验课程名称：光合色素的提取、理化性质、分离、吸收光谱 及含量的测定
教 师： 李忠光 开 课 学 期： 2013 至 2014 学年 第二 学期 填 报 时 间： 2014 年 4 月 21 日
云南师范大学教务处编印
一．实验设计方案 实验序号 实验二 实验名称 光合色素的提取、理化性质、分离、吸收光谱及含量的测定 实验时间 2014年3月、4月 实验室 睿智3栋 428 （一）实验目的 1、掌握光合色素的提取方法以及了解有关的理化性质。 2、掌握光合色素的分离方法以及了解有关的吸收光谱。 3、掌握用分光光度计测定叶绿素含量的方法。 （二）实验原理及实验流程或装置示意图 I 光合色素的提取与理化性质： 光合色素能溶于具有一定极性的有机溶剂，如丙酮、乙醇等。 提取液中无任何电子受体，因此可以观察荧光现象。 离体叶绿素在有氧气和光照条件下，发生光氧化作用，结构遭到破坏，形成加氧叶绿素等产物。 叶绿素是一种双羧酸酯，可以发生皂化反应。 叶绿素分子中Mg2+与仆啉环结合不稳定，可以被H+、Cu2+、Zn2+等离子所取代。 II 光合色素的分离与吸收光谱： 光合色素能溶于具有一定极性的有机溶剂，如丙酮、乙醇等。 不同光合色素的分子量、分子结构、极性、溶解度、支持物对它们的吸附力等不同，因而分配系数不同，故彼此可以分开。 叶绿素的卟啉环结构对光有很强的吸收，主要是红光和蓝紫光。 III 光合色素含量的测定 混合液中的两个或多各组分，只要它们的光谱吸收峰不互相重叠，仍然可以根据Lambert-Beer定律（A = k L C）求出各组分含量。Lambert定律：A = k L；Beer定律A = k C。叶绿素a、b在80%丙酮溶液中的Amax分别为663nm、645nm，由此得出：见推导过程 Ca = 12.7 A663 – 2.69 A645；Cb = 22.9 A645 – 4.68 A663 Ca+b = 8.02 A663 + 20.20 A64
（三）实验设备及材料 1、主要实验用具和仪器 研钵、试管、滤纸﹑三角瓶﹑天平﹑滤纸条﹑分光光度计﹑离心机﹑离心管﹑A4纸﹑吸管。 2、药瓶和试剂 CaCO3﹑石英砂﹑丙酮﹑20%KOH甲醇溶液﹑苯﹑50%醋酸﹑醋酸铜粉末﹑四氯化碳﹑80%苯丙。 3、实验材料：植物绿色叶片 (四)、实验方法步骤 I 光合色素的提取与理化性质 光合色素的提取：将植物叶片洗净并用滤纸洗干，准确称取2 g，放入研钵中并加入少许CaCO3和石英砂及5 ml丙酮，充分研磨，再加入10 ml丙酮，研磨，静止片刻，上清液过滤于三角瓶中，待用。 观察荧光现象：与光线垂直的方向观察色素颜色。 光破坏作用：1ml色素提取液于室内，1ml于太阳光下，30min后观察颜色变化。 皂化反应：取一支试管，加入色素提取液2.5ml，再加入30%KOH甲醇溶液1ml，摇匀，再加入苯2.5ml，轻轻摇动，沿试管壁慢慢加入自来水1ml，轻轻摇动后观察，注意观察整个过程颜色的变化。 取代反应：取一支试管，加入3ml色素，逐滴加入50%醋酸直至溶液变为黄褐色。倒出一半，加入少许醋酸铜粉末，酒精灯上加热，与另一半比较颜色的差异。 吸收光谱的变化：皂化和取代反应后的色素进行吸收光谱分析。 II 光合色素的分离与吸收光谱 光合色素的提取：将植物叶片洗净并用滤纸洗干，准确称取2 g，放入研钵中并加入少许CaCO3和石英砂及5 ml丙酮，充分研磨，再加入10 ml
丙酮，研磨，静止片刻，上清液过滤于三角瓶中，待用。 光合色素分离：剪取适当长度和宽度的滤纸条→ 用上行纸层析法分离色素→ 启动剂：石油醚：丙酮：苯=10：2：1。 吸收光谱的测定： 光合色素的吸收光谱：取色素溶液1 mL，加入丙酮3 mL，摇匀后在分光光度计上400到700 nm处每隔10 nm进行扫描。 各色素的吸收光谱：上述层析出的3~4种色素，分别剪下后溶于3 mL丙酮中，按上述方法扫描。 III 光合色素含量的测定 方法一：快速测定法 由于叶绿素a、b在652nm处有共同吸收，k = 34.5 L g-1. cm-1。可直接用便携式叶绿素测定仪测定植物叶片的叶绿素含量，最后浓度单位为mg/dm2。 方法二: 分光光度计法 色素提取：将上述植物叶片洗净并用滤纸吸干，准确称取已知Φ的叶圆片0.05g左右，加入少许CaCO3和石英砂及80%丙酮2ml，充分研磨，转入离心管中（离心机使用），再用5ml 80%丙酮洗研钵，转入离心管中，平衡，5000rpm离心10min, 记录上清液体积，取1ml稀释到4ml。 测定：以1cm比色皿分别测定A663、A645。使A控制在0.1 ~ 0.8之间。
(五)、实验结果与讨论 1、实验现象数据及观察结果： 光合色素含量测定 实验数据及计算 三类色素浓度: =0.862 =0.418A 由公式: 各叶绿素含量： V=10ml W=0.05g 由公式： =9.822mg/L =5.538mg/L
叶片面积： GSM=70-105 W=0.47g