以在设计正向引物时，一般需要加入3-6个碱基，最多时加入8个碱基，以满足正向引物的设计；
2. 点击Function框下的Primer，开始设计上下游引物； 3. 有经典颈环结构自然也就少不了常用的下游引物，一般使用CAGTGCAGGGTCCGAGGTAT;CGCAGGGTCCGAGGTATTC。同时还可以适当的在颈环序列中前后移动碱基设计下游引物；
4. 自动跳出的显示框中默认选择的是下游引物，正好符合先将常用下游引物输入的操作。下游引物相当比较固定，先输入下游引物对整个引物设计能够提高设计效率。
5. 点击框内的Edit Primers；选择所有引物序列；使用组合键“Ctrl+V”输入下游引物，输入方式为反向输入Reversed；点击OK；
点击Analyze分析引物基本信息；点击Prime寻找引物在序列里结合部位；点击OK确定下游引物；
6. 点击上下游转换键（图示），开始设计上游引物；点击Edit Primers；
7. 去除前面的9个N；点击Analyze；点击prime；查看前面不添加序列时的上游引物状况如何。
在这里的主要问题是Tm值太低，第二个问题是长度稍短。 8. 绝大多数情况下在前边添加的序列已GC为主，且在加GC序列时如果序列中间不以AT隔开则TM值上升比值高，同理加AT序列。不要出现GCGC、ATAT、GCCG、或连续4个不同的核苷酸，这些失误会造成引物评分的降低。个人喜欢加CGGGC、GCGGGC、A/TGCCCG等。
9. 例如加入ACGGGC（5’端加入，别在3’端）；点击Analyze；点击prime；查看引物的长度和TM值差不多了就行。当然不是全行了，还要查看引物的自身颈环结构，自身引物配对，重要指标为dG（当然还有其他，哈哈）。下游引物不用看了，因为是经典嘛，呵呵。点击OK。
10. 再查看一下引物对之间的匹对情况，加以对上游引物的修改，或者更换下游引物。有必要点击比对框下的All查看所以的匹对情况，呵呵，希望你懂的。
11. 想做好实验的同学可以在DNAstar的PrimerSelect中进一步查看引物对的状况，因为这两款软件让人感觉还是有很大不同的。例如PrimerSelect中引物的Tm值会比primer5.0中底5.5度左右（自己可以试一下）；同时PrimerSelect中对5’端中的匹对情况比较放松（可以用经典下游引物CAGTGCAGGGTCCGAGGTAT看一下）；primer5.0中有的dimer在更变或增减个被核苷酸时会不显示，需要PrimerSelect进一步查看完整的dimer。
12. 最后说一下，这个文本只是对最基本的miRNA引物设计进行说明，很多限制没有向大家说明，如果想做实验的可以联系生物公司让他们帮忙设计一下。或者找比较靠谱的师兄教一下。