切片如在二甲苯中出现白雾现象,说明脱水未尽,应退回乙醇中重新脱水,否则切片难以镜检。
19.封藏:中性树胶封存
因切片经二甲苯透明,使用中性树胶作为封藏剂,树胶可用二甲苯稀释至合适的稠度。
封藏的方法:
封片前应根据材料的大小,选用不同规格的盖玻片。材料透明后,在桌上放一张洁净的吸水纸,将含材料的载玻片从二甲苯中取出放在纸上(切片的一面向上),迅速地在切片的中央滴一滴树胶(千万不能待二甲苯干燥后再进行),用右手持小镊子轻轻地夹住盖玻片的右侧,稍为倾斜使其左侧与封藏剂接角,然后再缓慢地将盖玻片放下,这样就可以减少或避免产生气泡。如胶液不足,可以用玻棒再滴一滴树胶从盖玻片边缘补足。如胶液过多,可在干燥以后用刀刮去,并用纱布蘸二甲苯拭去残留的树胶。
染色结果:细胞核被苏木素染成蓝色,细胞质被伊红染色呈粉红色。
二、免疫组化染色
1. 石蜡切片,步骤同前。切片经贴片后,60℃烤片30min使蜡熔化,经二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10min,脱蜡。然后,将切片放入100%、95%、90%、80%、70%乙醇中3-5min,再放入蒸馏水中3min,水化。
2.脱蜡和水化后,用PBS(pH7.4,具体看所用抗体及染色试剂说明)冲洗3次,每次3分钟。洗瓶冲洗。
3. 根据抗体的要求,对组织抗原进行相应的修复。可选步骤,具体见抗体说明书。
4.每张切片加1滴或50μl 3%过氧化氢,室温下孵育10分钟,以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3次,每次3分钟。此步骤是对内源性过氧化物酶含量高的组织而言。 4. 除去PBS液,每张切片加1滴或50μl的第一抗体,室温下孵育60分钟或4℃过夜,具体参见每种抗体的说明书。PBS冲洗3次,每次3分钟。 5. 除去PBS液,每张切片加1滴或50μl 即用型MaxVisionTM 试剂或SP试剂,室温下孵育10-15分钟。PBS冲洗3次,每次3分钟。
6. 除去PBS液,每张切片加2滴或100μl新鲜配制的DAB或AEC溶液,显微镜下观察3-5分钟(DAB)或37℃环境下10-30分钟(AEC)。 7. 自来水冲洗,苏木素复染10分钟,PBS或自来水冲洗返蓝。如果用DAB显色,则切片经过梯度酒精脱水干燥,二甲苯透明,步骤同H-E染色,中性树胶封固;如果用AEC显色,则切片不能经酒精脱水,而直接用水性封片剂封片。