目的蛋白分子量大小确定转膜时间，可做预实验摸索经验）；
（5）丽春红染色（观察膜的转移情况）：将PVDF膜放入TBST 洗一次，再置于1：10稀释后的丽春红染色工作液中，在室温下摇动染色5min，倒回染液；用大量的蒸馏水浸泡膜（或用甲醇冲洗，条带会更清晰），直至水变清，无色蛋白条带清晰（注：膜可以用 TBST 或水重新洗后再进行染色；PVDF 膜需用甲醇再活化后用 TBST洗后进行封闭）； 2.6封闭
为防止一抗或/和二抗与膜的非特异性结合产生的高背景，因此需要进行膜的封闭。传统上有两种封闭液：脱脂奶粉或BSA，脱脂奶粉成本低但不能用于磷酸化蛋白（注：因脱脂奶粉含有酪蛋白，该蛋白本身就是一种磷酸化蛋白；使用脱脂奶粉会结合磷酸化抗体从而易产生高背景；某些抗体用 BSA 封闭时因不明原因可能会产生比脱脂奶粉更强的信号，请仔细阅读说明书注明的注意事项和膜的特殊的封闭方法）。
将 PVDF 膜条放入盛有约 20mL 5%封闭液的小盒中(膜正面朝上)，盖上盖子，室温水平摇晃 45 rpm，封闭2h。 2.7一抗孵育
（1）孵育 Buffer的配制：按说明书建议的稀释倍数，用过滤除菌后的TBST稀释一抗到合适浓度（GAPDH为1:10000），如果说明书没有建议的稀释倍数，则参照一般推荐的稀释倍数(1:100-1:3000)，一抗浓度过高会导致产生非特异性条带；某些实验室传统上在封闭液中孵育抗体，而有些实验室用不含有封闭剂的TBST孵育，结果因抗体而异，有时两者结果相同，有时不同；
（2）孵育：TBS/T溶液洗去膜表面多余的封闭液，每块加入TBS/T溶液10mL，摇荡95 rpm，5min×3次。按照预染彩色蛋白Marker的分子量指示条带确定目的蛋白位置，把PVDF膜剪成2条条带（目的蛋白和内参条带），立即完全浸泡于对应的一抗反应液中。4℃摇荡45 rpm，过夜（一抗回收后可加入 10% 叠氮钠 2μL中多次利用）。
注：a、孵育时间：一抗的孵育时间可从几小时至过夜不等，具体取决于抗体与蛋白的亲和性和蛋白的丰度，建议使用较高的抗体稀释倍数和较长的的孵育时间来保证特异性结合；
b、孵育温度：如果在封闭液中孵育过夜，应在4℃进行，否则污染会导致蛋白降解（特别是磷酸基团）。孵育一抗时需保持适当的摇动使之均匀覆盖膜，防止结合不均匀。
2.8二抗孵育
(1)TBST 洗膜：洗涤过程中放于摇床水平摇晃，摇荡95 rpm，5min×3次；
(2)孵育；按说明书推荐的倍数稀释二抗，如果说明书没有标出稀释倍数，则按常规的倍数稀释（1:1000 - 1:20,000）预实验，二抗的浓度过高也会导致非特异性条带，室温振荡1-2h；
(3)1×TBST 水平摇晃洗膜3次，每次至少 5min；再用TBS 洗一次，10min；准备进行 ECL 显色。 2.9 ECL显影
(1)物品准备：移液器、薄塑料袋、胶带、剪刀、镊子、枪头、曝光夹、废液缸、手套、EP 管、X-光胶片底片(密封防止曝光)、PVDF 膜、ECL 液、大平皿、大饭盒、水槽、将曝光夹、薄塑料袋、胶带事先准备好；
(2)配ECL 液：A、B 液等量1：1混合，吸完A液再吸B液时一定要换枪头，否则会造成污染，使试剂失效； 1min后，将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触；1min 后，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入 X-光片夹中。
(3) 显影和定影：在暗室中，将1×显影液和定影液分别到入塑料盘中；在红灯下取出 X-光片，用切纸刀剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大1cm）；打开 X-光片夹，把X-光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上 X-光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为 1-5min，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果；曝光完成后，打开 X-光片夹，取出 X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。显影时间一般为30s～3min（20～25℃），温度过低时（低于16 ℃）需适当延长显影时间；显影结束后，马上把 X-光片浸入定影液中，定影时间一般为 5～10min ，以胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。
注：显影和定影需移动胶片时，尽量拿胶片一角，手指甲不要划伤胶片，否则会对结果产生影响。
2.10灰度扫描X光胶片在凝胶自动成像仪上进行照相、数据分析。经凝胶密度扫描系统处理，测定各信号带灰度值。以内参GAPDH的蛋白信号灰度为内参照，计算待测蛋白的信号灰度值与它的灰度比值，作为待测蛋白的表达值。即：待测蛋白相对量＝待测蛋白信号灰度值/GAPDH蛋白信号灰度值。