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糖尿病模型大鼠骨骼肌VEGF、bFGF、
NGF的表达及意义
（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）
作者：成秀梅 王晓松 戎士玲 张永健
【摘要】 目的 探讨骨骼肌血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、神经生长因子(NGF)与糖尿病肌病发生的关系。方法 选用 SD 大鼠，随机分成对照组和模型组。以链脲佐菌素 50 mg/kg 腹腔注射制造糖尿病模型。8 w后观察大鼠骨骼肌病理形态学改变，同时采用免疫组化方法检测骨骼肌 VEGF、bFGF、NGF蛋白表达情况。结果 模型组大鼠骨骼肌表现为普遍性肌萎缩，肌纤维变性坏死；VEGF、bFGF、NGF在模型组大鼠骨骼肌中的表达明显减少。结论 VEGF、bFGF、NGF的表达异常参与了糖尿病肌病的发生发展。
【关键词】 糖尿病； 骨骼肌；血管内皮生长因子；碱性成纤维细胞生长因子；神经生长因子
骨骼肌是胰岛素刺激状态下摄取葡萄糖的主要部位。研究表明，骨骼肌是全身利用葡萄糖最重要的组织之一，也是高血糖损害的主要
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靶位。肌无力、肌肉酸痛、肌萎缩是糖尿病的常见症状，而糖尿病肌损害又加重了外周胰岛素抵抗〔1〕。因此，研究骨骼肌在糖尿病状态下的各种病理改变对于防治糖尿病及其并发症具有重要意义。近年来，血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF） 和神经生长因子（NGF）在骨骼肌生长发育、肌肉内血管生成及肌肉损伤后修复中的作用越来越受到人们的重视。本实验旨在探讨VEGF、bFGF、NGF在糖尿病模型大鼠骨骼肌的表达情况。 1 材料与方法 1.1 动物模型及分组
选用雄性SD大鼠25只，体重200～220 g，自由饮水进食，饲养于清洁级动物实验室内。适应性喂养1 w后，随机分为2组：对照组10只，模型组15只。将模型组15只大鼠禁食12 h后，腹腔注射1%链脲佐菌素枸橼酸缓冲液（购自美国Sigma公司，枸橼酸缓冲液为0.1 mmol/L，pH4.2～4.5），按50 mg/kg腹腔内一次注射;72 h后，取尾尖血测定血糖值。凡血糖＞16.7 mmol/L者纳入实验，本实验有12只造模成功。对照组10只大鼠仅腹腔注射等体积的枸橼酸钠缓冲液。
1.2 标本收集及检测方法
8 w后，禁食8 h，断头取血，离心，分离血清，采用葡萄糖氧化酶法测定血糖。断头处死后，迅速剖取大鼠坐骨神经周围肌肉组织（约0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm）于4%多聚甲醛中固定，常规脱水、石蜡包埋、切片， HE染色，观察骨骼肌组织形态变化；采用免疫组化
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染色，观察骨骼肌VEGF、bFGF、NGF 表达（VEGF、bFGF试剂盒购于Santa Cruz公司，NGF试剂盒购于北京博奥生物技术有限公司）。细胞质内见染成棕黄色颗粒的骨骼肌细胞，认定为表达阳性细胞。用Nikon显微照相系统对骨骼肌组织切片进行观察、照相。采用HPIAS1000高清晰度彩色病理图像分析系统，在400倍视野下每张切片取5个视野，测定平均灰度值作半定量分析，用以反映其蛋白表达水平。
1.3 统计学处理
采用SPSS12.0统计软件进行统计分析，所有数据均用x±s表示，对所测结果进行正态性及方差齐性检验，组间比较采用单因素方差分析。 2 结果 2.1 一般情况
造模前各组大鼠反应灵敏，毛发光滑，毛色正常，饮食正常，行动敏捷。STZ注射造模3 d后，大鼠开始出现多尿、多饮、多食症状，并逐渐出现消瘦、精神萎靡、体毛枯黄、稀疏、大便不成形、体形明显消瘦、行动迟缓、反应迟钝等症状，整体状态差。 2.2 血糖测定比较
实验结束时，对照组大鼠和模型组大鼠的血糖分别为（6.75±0.58）、（31.32±2.16）mmol/L，模型组血糖明显高于对照组（P0.01）。说明糖尿病模型复制成功。 2.3 病理形态学改变
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对照组大鼠骨骼肌表现为正常的组织学结构，肌膜完整、清晰，肌纤维上明暗条纹规则整齐。模型组大鼠骨骼肌表现为普遍性萎缩，纤维变性、水肿，部分区域坏死，纤维断裂，肌丝走行紊乱，核固缩，横纹模糊消失。
2.4 骨骼肌VEGF、bFGF及NGF蛋白表达
对照组大鼠骨骼肌可见VEGF﹑bFGF、NGF表达，阳性细胞呈棕黄色。模型组大鼠骨骼肌中VEGF、bFGF、NGF的蛋白表达平均灰度明显高于对照组（P0.01），表明模型组大鼠骨骼肌中VEGF、bFGF、NGF蛋白表达水平低于对照组。见表1和图1。表1 各组大鼠骨骼肌中VEGF、bFGF、NGF，表达的平均灰度(略)。 3 讨论
骨骼肌由具有独特的代谢和循环特征的不同纤维类型所组成，糖尿病状态下均普遍受损，组织形态学改变主要表现为肌纤维萎缩和退化、灶性肌丝降解和线粒体异常。引起糖尿病肌病的因素包括糖尿病血管病变（以微血管病变为主）、代谢紊乱（多元醇通路和己醣胺通路的激活、氧化应激和糖基化终末产物的形成）、糖尿病神经病变。骨骼肌病变将使骨骼肌对胰岛素刺激的葡萄糖摄取敏感性下降，葡萄糖摄取减少，周围胰岛素抵抗恶化，糖尿病的代谢紊乱进一步加重。特别是高血糖对骨骼肌及其相应血管神经损害，引起其结构和功能改变。
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VEGF是目前所知最强的内皮细胞选择性有丝分裂因子和血管生成因子，能特异地直接作用于血管内皮细胞，其作用涉及促进内皮细胞增殖、提高血管通透性、改变细胞外基质、血管生成和维持功能等生物学行为，在微血管结构和功能改变的病理生理过程中发挥重要作用〔2〕。糖尿病骨骼肌中闭塞血管周围侧支血管形成明显减少，而在动脉阻塞病理进展及侧支血管网逐步建立过程中，VEGF起着极其重要作用。缺血骨骼肌VEGF蛋白水平的提高可以通过旁分泌作用促进内皮细胞的增殖、移行，以形成新的毛细血管网络〔3〕。本实验通过免疫组化对骨骼肌内VEGF蛋白变化进行研究发现，模型组大鼠骨骼肌中VEGF表达明显低于对照组，糖尿病大鼠骨骼肌VEGF的低水平导致组织新生血管下降。因此，VEGF水平下降可能也是糖尿病骨骼肌萎缩的重要原因，适当增强VEGF表达可能是治疗糖尿病骨骼肌病变的有效方法。
bFGF是一种具有广泛生物活性的肽类物质，对肌卫星细胞、成肌细胞、血管内皮细胞等中胚层来源的细胞有明显的促增殖作用，在骨骼肌损伤后的修复中起重要作用。本实验应用免疫组化方法检测大鼠骨骼肌中bFGF蛋白表达的变化。结果显示，模型组骨骼肌bFGF表达明显低于正常组，提示糖尿病骨骼肌病变能抑制内源性bFGF的表达或诱发其破坏增加。本实验发现，糖尿病大鼠骨骼肌bFGF蛋白的阳性表达率明显低于正常组，证实了高糖环境可以抑制骨骼肌内源性bFGF的表达。高糖还可以引起bFGF发生非酶蛋白糖