第八章 微生物的遗传变异和育种
第一节 遗传变异的物质基础 一、3个经典实验
（一）经典转化试验、 最早进行转化（transformation）实验的是F. Griffith（1928年），他以Streptococcus pneumoniae （肺炎链球菌，旧称“肺炎双球菌”）作为研究对象。 ——DNA是转化所必需的转化因子 （二）噬菌体感染实验 （三）植物病毒的重建实验
为了证明核酸是遗传物质，H. Fraenkel-Conrat（1956）用含RNA的烟草花叶病毒（TMV）进行了著名的植物病毒重建实验。
——遗传物质是核酸（RNA）而非蛋白质、 二、朊病的发现与思考
亚病毒的一种：具有传染性的蛋白质致病因子，迄今为止尚为发现该蛋白内含有核酸。 其致病作用是由于动物体内正常的蛋白质PrP c改变折叠状态为PrP sc所致，而这二种蛋白质的一级结构并没有改变。 第二节 基因突变和诱变育种 一、基因突变（genemutation）
一个基因内部遗传结构或DNA序列的任何改变
简称突变，是变异的一种，泛指细胞内（或病毒粒内）遗传物质的分子结构或数量突然发生的可遗传的变化，可自发或诱导产生。 突变几率一般很低（10-6～10-9）
野生型菌株（wild type strain）——从自然界分离到的菌株，简称野生型。
突变株（mutant）——野生型经突变后形成的带有新性状的菌株，又称突变体或突变型。 （一）突变类型
选择性突变株（selective mutant）
——凡能用选择性培养基（或其他选择性培养条件）快速选择出来的突变株。 非选择性突变株（non-selective mutant）
（二）突变率（mutation rate）
每一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率
某一单位群体在每一世代（即分裂1次）中产生突变株（mutant，即突变型）的数目来表示
（三）基因突变的特点 （1）自发性 （2）非对应性
——突变的性状与引起突变的原因间无直接的对应关系。 （3）稀有性 （4）独立性 （5）可诱变性 （6）稳定性 （7）可逆性
（四）基因突变自发性和不对应性的实验证明
三个经典实验——变量实验、涂布实验、影印实验
影印的作用是保证这3个平板上所长出的菌落的亲缘和相对位置保持严格的对应性。 二、突变与育种
（一）自发突变与育种（breeding by spontaneous mutation） 1. 从生产中育种
诱变育种的特点（1）提高突变率，扩大突变谱 （2）有效地改良个别、单一性状 （3）缩短育种年限
（4）定向变异和有益突变的频率低 1. 诱变育种的基本环节
2. 诱变育种中的原则
（1）选择简便有效的诱变剂
物理因素：引起电离辐射的X射线、γ射线和快中子等
非电离辐射类的紫外线、激光和离子束（ion beam，有小型加速器提供）等 化学诱变剂：主要有烷化剂、碱基类似物和吖啶类化合物
烷化剂可与巯基、氨基和羧基等直接发生反应，更易引起基因突变。 最常用的烷化剂
N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍（NTG）、 甲基磺酸乙酯（EMS）、 甲基亚硝基脲（NMU）、 硫酸二乙酯（DES）、
氮芥、乙烯亚胺和环氧乙烷等。 （2）挑选优良的出发菌株
出发菌株（original strain）是指用于育种的原始菌株，选用合适的出发菌株有利于提高育种的效率。
合适的出发菌株来源：
① 由自然界直接分离获得的野生型菌株； ② 在生产中经历生产条件考验的菌株； ③ 已经过诱变甚至多次改造的菌株；
④ 选用对诱变剂敏感性较高增变变异株；等等。 （3）处理单细胞或单孢子悬液
在诱变育种中，所处理的细胞必须是单细胞、均匀的悬液状态。 一方面，分散状态的细胞可以均匀地接触诱变剂， 另一方面，又可避免长出不纯菌落。 菌悬液制备目的在于提高诱变处理的效果
诱变剂一般只作用于DNA双链中的某一条单链，故某一突变还是无法反映在当代的表型上。只有当经过DNA的复制和细胞分裂后，这一变异才会在表型上表达出来，于是出现了不纯菌落，这就叫表型延迟（phenotypiclag）。 用于诱变育种的细胞应尽量选用单核细胞， 例如，细菌的芽孢；
霉菌或放线菌的分生孢子。 （4）选用最适的诱变剂量 诱变剂的作用有三条： 一是提高诱变的频率 二是扩大变异的幅度
三是使变异向正变的方向移动（产量提高
凡在提高诱变率的基础上，既能扩大变异幅度，又能促使变异移向正变范围的剂量，就是合适的剂量。
两条重要的实验曲线 横坐标 纵坐标 ① 剂量存活率曲线 诱变剂的剂量 细胞存活数的对数值 ② 剂量－诱变率曲线 诱变剂的剂量 诱变后获得的突变细胞数
通过比较上述两曲线，可找到某诱变剂的剂量－存活率－诱变率三者的最佳结合点。 通常采用低剂量、长时间处理。
（5）充分利用复合处理的协同效应（synergism）
诱变剂的复合处理常常表现出明显的协同效应，这对育种工作是有利的。 复合处理有几类：
① 两种或多种诱变剂的先后使用； ② 同一种诱变剂的重复使用； ③ 两种或多种诱变剂的同时使用。
（6）利用和创造形态、生理与产量间的相关指标
为了大大提高育种时初筛的效率，必须进行大量的分析测定和统计工作，并找到形态变异与产量变异两者间的相关性。
利用鉴别性培养基的原理或其他途径，就可有效地把原先肉眼无法观察的生理性状或产量性状转化为可见的“形态”性状。 ——快速平板检出法
在琼脂平板上，通过观察测定某突变菌落周围 蛋白酶水解圈的大小、
淀粉酶变色圈（用碘液使淀粉显色）的大小，
氨基酸显色圈（将菌落用打孔机取下，转移到滤纸上，再用茚三酮试剂显色）的大小， 柠檬酸变色圈（可在厚滤纸上培养，用溴甲酚绿作指示剂）的大小， 抗生素抑制圈的大小，
指示菌生长圈的大小（测定生长因子产生），
纤维素酶对纤维素水解圈（用刚果红染色）的大小， 外毒素的沉淀反应圈的大小等，
均可为初筛工作中估计某突变株代谢产物量的“形态”指标。 （7）设计高效筛选方案
初筛——以量为主（选留较多有生产潜力的菌株）
复筛——以质为主（对少量潜力大的菌株的代谢产物量作精确测定） （8）创造新型筛选方法 . 3类突变株的筛选方法 （2）抗药性突变株的筛选
基因突变使菌株对某种或某几种药物，特别是抗生素，产生抗性。 正选择标记
（突变株可直接从抗性平板上获得-----在加有相应抗生素的平板上，只有抗性突变能生长。所以很容易分离得到。）
梯度平板法（gradient plate）是定向筛选抗药性突变株的一种有效方法，通过制备琼脂表面存在药物浓度梯度的平板、在其上涂布诱变处理后的细胞悬液、经培养后再从其上选取抗药性菌落等步骤，就可定向筛选到相应抗药性突变株。 （3）营养缺陷型突变株的筛选
在具体使用时多用hisC-和hisC+，分别表示缺陷型和野生型。 ① 与筛选营养缺陷型突变株有关的3类培养基 a. 基本培养基（MM，符号为［－］）
仅能满足某微生物的野生型菌株生长所需的最低成分的组合培养基，称MM。 b. 完全培养基（complete medium，CM，符号为［＋］）
凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基，称为CM。
一般可在基本培养基中加入一些富含氨基酸、维生素、核苷酸和碱基之类的天然物质，如蛋白胨或酵母膏等配制而成。
c. 补充培养基（supplemental medium，SM，符号为［A］或［B］等）
凡只能满足相应的营养缺陷型突变株生长需要的组合或半组合培养基，称为SM。 在基本培养基上再添加对某一营养缺陷型突变株所不能合成的某相应代谢产物所组成，可专门选择相应的突变株。
② 与营养缺陷型突变有关的3类遗传型个体
野生型（wild type，wild strain） 营养缺陷型（auxotroph）
原养型（prototroph）——经回复突变或重组后产生的菌株（A＋B＋） ③ 营养缺陷型的筛选方法
第一步，诱变剂处理
第二步，淘汰野生型 1）抗生素法：
原理： 青霉素、制霉菌素等抗生素作用于生长着的微生物细胞，对休止态细胞无作用。
方法：菌培养在含抗生素的MM基中。 2）菌丝过滤法：
适用于丝状（放线菌、霉菌）
原理：基本培养基上只有发育成菌丝；auxo孢子可通过滤膜，野生型菌丝不能通过。
3）差别杀菌法：
基本培养基上只有野生型生长，加热杀死野生型营养体，保留auxo芽孢。 细菌——80℃ 酵母——60 ℃
适用于产芽孢、孢子菌。
第三步，检出缺陷型 1）逐个检出法 2）影印平板培养法
3）限量补充法——（在mm中加0.01%蛋白胨，auxo菌落小，野生型菌落大 3）夹层培养法
第四步，鉴定缺陷型 1）生长谱法
方法简便；回变和污染不影响结果；测定物质可为粉末 或纸片