SDS-PAGE 超速离心 凝胶过滤 粘度法 生物质谱技术
15.
简述SDS-PAGE法测定蛋白质分子量的关键步骤。
1. 电泳槽的安装：取两块玻璃板→将带玻璃条的板（高板）放置桌面上→在上面放置“U”型橡胶条→最后将凹槽玻璃板（低板）压在高板上，置于电泳槽内，用锲子压紧。 2. 凝胶液的制备与灌装：配置20ml凝胶液：在小烧杯中依次加入5ml 30%凝胶储液，10ml PH 7.2 凝胶缓冲液(用前混匀再取)，2ml 1%TEMED，2.6ml重蒸水，0.4ml 10%过硫酸铵混匀后→立即沿高板内侧倒凝胶液于两板之间直至低板上沿→插上梳子置于35oC培养箱中放置15min，待胶凝后取下“U”条→重新将胶板放置于电泳槽内→向外槽内加三分之一槽深电极缓冲液→向内槽加入电极缓冲液没过低板→最后拔出梳子。 3. 加样：用微量进样器加入10μl标准蛋白于中间胶槽内→其余槽内加入10μl下列样品①牛血清蛋白②绿豆分离蛋白
4. 电泳：连接电极线，高板外侧接正极，低板内侧槽接负极，打开电源→调电流120mA→电泳2h（当指示剂前沿超过二分之一胶长时停止）
5. 剥胶：取下胶板倒去电极缓冲液→测量指示剂迁移距离和染色前胶长，然后将胶板置于水龙头下方冲玻板四周直至胶与玻璃板分离
6. 染色与固定：将胶板放入染色盒内→向其中加入0.1%考马斯亮蓝R250使其浸没置于摇床上染色过夜
7. 脱色：用10%乙酸溶液脱色至谱带清晰，测定脱色后胶长及各谱带迁移距离。
16.
写出电泳法测定蛋白质分子量的计算公式并说明各符号的含义。
17.
试述赖氨酸含量测定的实验原理
蛋白质中赖氨酸的含量是谷物品质的主要指标之一。由于动物及人类不能合成，须从食物中得以补充，为此培育高含量赖氨酸的谷物，对于提高营养价值有重要意义。本实验分别用茚三酮溶液显色法和染料结合法，测定小麦种子中赖氨酸含量。 谷物蛋白中赖氨酸残基有自由的ε－NH3与茚三酮试剂可发生颜色反应，生成紫红色物质，其颜色深浅与赖氨酸残基的数目成正相关，而其它氨基酸没有自由氨基，不能发生这一反应。选用碳原子数目与赖氨酸相同的亮氨酸，配成标准溶液，做出标准曲线，可用以测定谷物蛋白内赖氨酸的含量。
18.
氨基酸含量测定的方法有几种？比较各方法特点。
常用的有,半定量法：纸层析法；定量法：HPLC柱前衍生化法.
19.
简述测定赖氨酸的关键步骤。
1.标准曲线的制作（每2组4人做1标准曲线）
2、样品的处理与测定：在电子天平上称取小麦粉10mg于具塞试管底部→加1ml 2% 碳酸钠于80℃水浴中保温提取10min→加2ml茚三铜试剂80℃水浴中保温30min后冷却至室温→加5ml 95%乙醇和5ml蒸馏水充分混匀后转移至离心管中3000转/分 离心3min（离心前必须平衡）→取上清液测A（以1号管调零）
20.
写出计算赖氨酸的公式并说明各符号的含义。
21.
试述甲醛滴定法测定氨基氮的实验原理。
常温下甲醛能迅速与氨基酸的氨基结合生成亚羟甲基化合物，使上述平衡右移促使NH3+释放H+，从而使溶液酸度增加，滴定终点移至酚酞的变色域内（pH值9.0左右），根据滴定终点时所消耗标准碱的量即可算出反应体系中存在的游离氨基即氨基氮的含量如果样品为一种已知的氨基酸，即可算出该氨基酸的含量。如果样品为未知氨基酸或几种氨基酸的混合物，则只能算出其氨基氮的含量。
22.
简述甲醛滴定法测定氨基氮的关键步骤。
已知氨基酸溶液中氨基酸含量的测定:
取3只三角瓶编号①2ml 1% 甘氨酸②2ml 1% 甘氨酸③2ml 水（空白）
均加5ml 水和5ml中性甲醛（用前加2滴 0.5% 酚酞滴加0.1mol/LNaOH调至淡红色），及4滴 0.5%酚酞混匀→用0.1mol/L滴至粉红色出现为止→分别记下耗去标准碱的体积(V1.V2.V0）
23.
写出甲醛滴定法测定甘氨酸的公式并说明各符号的含义。
24.
试述纸上层析法分离氨基酸的实验原理。
纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析，滤纸纤维上的－OH具有亲水性，因此能吸附
一层水作为固定相，而通常把有机溶剂作为流动相。有机溶剂自上而下流动，称为下行层析；自下而上流动，称为上行层析。流动相流经支持物时与固定相之间连续抽提，使物质在两相之间不断分配而得到分离。
25.
氨基酸分离的方法有几种？比较各方法特点。
氨基酸的分离提纯方法主要有沉淀法、离子交换法、萃取法、电渗析等
离子交换法，根据氨基酸是两性电解质这一特征,以及目的氨基酸与杂质氨基酸pK、pI值的差异,利用离子交换树脂对各种氨基酸吸附能力的不同对氨基酸进行分离纯化。离子交换法的分离步骤主要包括树脂的处理、装柱、平衡、加样、洗脱等步骤 沉淀法，沉淀法是历史最悠久的分离纯化方法，目前仍在工业上发挥着重大的作用。氨基酸工业中常用沉淀法有等电点沉淀法，特殊试剂沉淀法和有机溶剂沉淀法。沉淀法原理是根据某些氨基酸可以与某些有机或者无机化合物结合而形成沉淀，可以利用这种性质向溶液中加入特定的沉淀剂，使目标氨基酸沉淀，与其他氨基酸分离，在分离后再将氨基酸与沉淀剂分离即可。
萃取法，萃取法主要包括反应萃取法、溶剂萃取法、反向微胶团萃取、液膜萃取法等。其中，反应萃取法是选择适当的萃取剂，使萃取剂解离出来的离子与氨基酸解离出来的离子发生反应，生成可以溶于有机相的物质，从而使氨基酸从水相进入有机相，进而分离氨基酸。溶剂萃取法，由于氨基酸是离子型化合物，氨基酸在物理萃取时难以高效提取的，因此常用化学发来萃取氨基酸。反向微胶团萃取的原理相对复杂，表面活性剂自发形成的纳米级的一种聚体，它的极性尾在外与非极性的有机溶剂接触，而极性头则排列在内形成极性核，极性核溶于水后就形成了特殊的“水池”，当含有氨基酸的水溶液与含反相微胶团的有机溶剂相混合时，氨基酸以带电离子状态进入反相微胶团的“水池”内或微胶团球粒的界面分子膜层内而被分离。液膜萃取是将第三者液体辗成膜状，利用液膜的选择透过性，从而使目标产物透过半透膜进行分离，这是一种新型的氨基酸分离法，常用于乳酸液泡膜分离L-苯丙氨酸、精氨酸等氨基酸。
电透析，由于氨基酸拥有不同的等电点，故可以通过控制溶液的PH值，使氨基酸带有正负电荷，即当PH大于等电点时，带有负电荷，将氨基酸放置在电场中，会带上负电，并且移向正极，相反，PH值小于等电点时，则带上正电荷，氨基酸向负极移动。电透析主要有毛细电透析等方法，通过这种方法可以高效而精确地分离氨基酸。
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简述纸上层析法分离氨基酸的关键步骤。
1、平衡：将展开剂（乙醇：水：冰乙酸＝50:10:1）放入培养 皿中置于密闭容器内使其充满展开剂（24h左右）
2、点样：取滤纸1张用铅笔在距下方2cm处划线并将所得线段分成5等分从而得到4个标记点，用微量进样器分别取5μl下列样品①phe②lys③pro④混合Aa向4个标记点上加样（样品扩散中?≤1cm）
3、展层：将滤纸卷成筒状且不能够重叠，并用棉线扎紧然后垂直放入培养皿中进行展层2h（当展开剂沿到达滤纸长度三分之二时，即可取出）测量展开剂前沿移动距离（a） 4、显色：用0.1%茚三酮-丙酮溶液朝点样面喷雾（不要喷得太多）然后将滤纸置于电炉上方20cm处加热直至斑点出现为止，测量各斑点中心到点样点距离（b）
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影响纸上层析法分离氨基酸的因素有哪些？
温度,层析液,样品的浓度等
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试述凝胶层析法测定蛋白质分子量的实验原理。
聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质相对分子质量的方法，主要是根据各蛋白质组分的分子大
小和形状以及所带净电荷多少等因素所造成的电泳迁移率的差别。 在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），使所有蛋白质颗粒表面覆盖一层SDS分子，导致蛋白质分子间原有的电荷差异消失，此时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小。当蛋白质的分子量在15000～200000之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈直线关系。
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简述凝胶层析法测定蛋白质分子量的关键步骤。
1. 电泳槽的安装：取两块玻璃板→将带玻璃条的板（高板）放置桌面上→在上面放置“U”型橡胶条→最后将凹槽玻璃板（低板）压在高板上，置于电泳槽内，用锲子压紧。 2. 凝胶液的制备与灌装：配置20ml凝胶液：在小烧杯中依次加入5ml 30%凝胶储液，10ml PH 7.2 凝胶缓冲液，2ml 1%TEMED，2.2ml重蒸水，0.8ml 10%过硫酸铵混匀→立即沿高板内侧倒凝胶液于两板之间直至低板上沿→插上梳子放置15min，待胶凝后取下“U”条→重新将胶板放置于电泳槽内→向外槽内加三分之一槽深电极缓冲液→向内槽加入电极缓冲液