附件3：
湖南省中医药科研计划项目申请书
上册（任务书）
课题名称： 二甲双胍联合滋肾活血汤对2型糖尿 病大鼠CRP、TNF-a的影响的实验研究 课题类别： 一般项目 承担单位： 湖南中医药大学 课题负责人： 颜国富 联系手机： 13607306636 课题申请时间： 2011.4.18
湖南省中医药管理局
填写说明
一、请用A4纸打印，页面不敷可另加页。
二、所有栏目应如实填写，确无填写内容请填“无”。 三、课题研究周期一般设计为二年，最长不超过四年。
共同条款
签约各方应共同遵守以下条款：
一、湖南省中医药管理局为甲方，课题牵头单位为乙方，牵头单位所在市州卫生行政部门或省部直单位为丙方。
二、任务执行过程中，乙丙方如需变更任务书内容，应向甲方提出书面说明，经批准后实施。在未接到正式批准前，乙丙方须按原任务书履行，否则，后果由乙丙双方负责。
三、本任务书为下达湖南省中医药管理局科技计划项目使用，甲丙方对课题研究有监督权、处置权。乙方因主、客观原因不能按任务书约定内容执行时，甲方有权终止任务，乙方应偿还已投入的全部经费。
四、本任务书由签约方各持一份。
一、基本情况
名称 二甲双胍联合滋肾活血汤对2型糖尿病大鼠CRP、TNF-a的影响的实验研究 研 所属学科 生物与医药 研究工作总经费 3万 究 研究工作起止年月 2011.6—2013.6 课 本课题成果预期达到国内领先水平，尤其在糖尿病专业领域采用中药预题 预期成果 防与治疗糖尿病血管并发症方面起到指导性作用。 序学课题中姓名 身份证号 职称 所在单位 签名 号 历 分工 全面负责指导湖南中医药课题全颜国本1 430602196211240016 教授 大学附属岳过程的富 科 设计实阳医院 施 课 具体设题 计实施湖南中医药组 主治硕方案与2 胡仙 430181198008101382 大学附属岳 主 医师 士 资料总阳医院 要 结 成 员 具体设计实施湖南中医药李淑硕方案与3 430103196901231546 教授 大学附属岳 君 士 资料总阳医院 结 湖南中医药实施设硕4 冯佩 430621198410250469 医师 大学附属岳计方案 士 阳医院 5 序单位名称 承 担 号 湖南中医药大学附属岳阳医院 单 1 位 2 3
二、研究目标
地址及联系电话 岳阳市枫桥湖路269号 本研究基于多年临床经验和前期大量基础研究工作，旨在进一步寻求以中西医结合为主，具有良好价效比，适合中国国情的治疗和预防糖尿病血管病变的有效方药。为了进一步探讨该方的作用机制，特设计此实验以深入研究，也为其将来的开发提供科学试验依据。
三、 主要研究内容和技术方案 一．研究内容 1. 糖尿病血管病变早期阶段病理改变的内在机制研究。 2.中药对于糖尿病血管病变的预防和治疗作用效果评估。 3.中药对于糖尿病血管病变的预防和治疗作用的机理研究。 4.中药预防和治疗糖尿病多系统作用途径研究。 5.评价中药和化学药物对于糖尿病血管病变的早期预防和治疗的效果差异。 6. 中西医结合对于糖尿病血管病变的预防和治疗作用效果评估。 7.筛选预防和治疗糖尿病血管病变有确切作用效果的中药 二、技术方案 、拟采取的研究方法、技术路线和实验方案 1. 实验对象： 清洁级近交系雌性Wister大鼠42只，6月龄，重约150g-200 g，由湖南省中医药大学动物实验中心提供。 2. 实验材料饲料及饲养环境： 空白对照组常规饮食，造模组喂给高糖高脂高胆固醇饲料。此饲料由本院实验动物中心自配，其中含10%蔗糖，10%猪油，2.5%胆固醇。每笼10只，自由摄食、饮水。室温18-22°C，空气流通，相对湿度55-70%，12小时光照维持，昼夜循环。 药品及试剂： 滋肾活血汤为湖南省中医药大学附属岳阳医院中药房一次性购买。 二甲双胍：北京嘉德制药有限公司生产。 实验试剂 NO试剂盒 碧云天生物技术研究所 INS放免试剂盒 TNF-α放免试剂盒 ET放免试剂盒 SABC免疫组化试剂盒 浓缩型DAB显色试剂盒 主要仪器： 北京北方生物技术研究所 北京北方生物技术研究所 北京北方生物技术研究所 博士德生物工程有限公司 博士德生物工程有限公司 BIOMIAS图像分析系统： 湖南中医药大学基础研究院 日本尼泰克ACE919型全自动生化分析仪。 法国S-500P半自动生化分析仪。 光镜:OLYMPUS BX50 日本产 电镜:日本JEM-1010（HC）100KV高衬度透射电子显微镜 3. 实验方法： 造模方法：造模组高糖高脂高胆固醇饲料喂养2个月后，禁食12小时，断尾取血，血糖值为16.7mmol/l-25mmol/l者入选。造模成功后，各组恢复常规饮食。 分组方法：动物购回，适应性喂养一周后，随机分成空白对照组、模型对照组、中药组、二甲双胍组、中药+二甲双胍组（n=6），除空白对照组外，其他动物均用于造模。造模后，选择符合模型标准的大鼠分别随机分组如下：模型对照组、中药组、二甲双胍组、中药+二甲双胍组，各组数量保持相等，每组均为6只。 给药方法：从造模成功后的第一天开始给药，疗程为8周。灌胃情况如下： 1中药组：每日灌胃量相当于临床成人用药量的10倍，即6ml/kg，每日1次，○共8周； 2二甲双胍组：每日灌胃量相当于临床成人用药量的10倍，即6ml/kg，每日1○次，共8周； 3中药+二甲双胍组：每日灌胃量相当于临床成人用药量的10倍，即6ml/kg，每○日2次，共8周； 4模型对照组：每日灌胃量相当于临床成人用药量的10倍，即6ml/kg，每日1○次，共8周； 5空白对照组：每日灌相当于临床成人用药量的10倍的生理盐水，即6ml/kg，○每日1次，共8周； 测试指标及取材 动物给药8周后，处死前12h禁食，股动脉取血约4～5ml，其中1.5ml于EDTA+抑肽酶的抗凝试管内，用做ET的检测。余血放置于试管内，离心取血清，备做NO、INS、TNF-α、TG、BUN、CREA、UA的检测。立即取胰腺、肝脏、肾脏病理切片：HE 染色；股动脉、腹主动脉病理切片：MASSON 染色 4.统计方法： 所有数据均采用SPSS统计软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（x±S）表示。两样本均数比较采用成组t检验（One- Sample T Test），多样本均数的两两比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。以P＜0.05作为有显著性差异。 5.技术路线：（附图于后） 实验开始前，随机抽取6只大鼠作为空白组对照组，并立即断头处死，取血标本测定生化指标。然后迅速剥离取出双侧髂股动脉、腹主动脉、胰腺、肾脏用生理盐水冲洗，10%福尔马林原位固定24h，常规制片，动脉用MASSON染色，内脏用HE染色，做光镜、电镜检查。造模成功后，选取成模大鼠，随机分成模型对照组、中药组、二甲双胍组、中药+二甲双胍组。除模型对照组外，余组均给药。治疗8周后，将全部大鼠处死，收集上述生化、放免及病理切片等各项指标。各组为6只算入统计，认真详细记录所有数据。