C．PCR法
挑取一些独立的转化质粒进行小规模培养，按碱裂解法少量制备质粒DNA，然后用与插入片段两端互补的特异引物进行PCR扩增，扩增出与目的序列大小一致的特异片段的转化子为阳性重组子。有关抽提质粒DNA和PCR操作方法请参阅质粒DNA的抽提和基因的PCR扩增技术。 D．限制性酶切法
挑取一些独立的转化质粒进行小规模培养，按碱裂解法少量制备质粒DNA，然后用插入片段两端互补的限制酶进行消化，以释放出插入片段，然后通过凝胶电泳检测插入片段和载体的大小。若外源DNA是经单酶切后插入，即两端是同一个内切酶，这时除了对转化子进行单酶切，以观察是否有相同大小的外源DNA插入外，还要对插入片段的方向进行鉴别。有关质粒DNA抽提和限制性酶切分析方法的操作请参阅质粒DNA的抽提和DNA限制性酶切分析技术。 E．杂交筛选
将平板上待筛选的菌落转移到硝酸纤维膜上，然后在膜上原位裂解细菌并使释出的DNA非共价结合于滤膜上。在对滤膜上尚未结合DNA的其它活性部位作杂交封闭处理后，滤膜与标记的特异核酸探针杂交。由于探针与靶DNA有很好的碱基配对关系，故能牢固结合于靶DNA上，而非特异结合在膜上的探针，则很容易在以后的洗脱过程中洗去。洗涤后的滤膜，贴压上X-光胶片，暴光一段时间后，作显影、定影处理。如果待筛菌落中含有靶DNA序列，则在自显影胶片上可见到阳性杂交信号，与滤膜对应的平板上的菌落即为所需的克隆。 F．DNA序列分析
由于DNA序列分析费时、费钱，故本法不作常规筛选之用。只有在经过其它筛选手段仍不能确定是否为目的克隆的情况下，对最有希望的克隆作序列分析，最终予以确认或否定。
仪器与主要试剂：
（二） 仪器
1． 隔水式电热恒温培养箱 2． 超净工作台 （三） 试剂
1． LB固体培养基：1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl，用5mol/LnaOH
调节PH值至7.4后，加入2%的琼脂，于103.42kPa（15磅）灭菌20分钟。
2． X-gal储存液：将X-gal溶于二甲基甲酰胺中，配成20mg/ml浓度的溶液，
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装于玻璃或聚丙烯管中，用锡箔纸包裹，储存于-200C。
3． IPTG溶液：将2克IPTG溶于8 ml水中，用水调节体积至10ml。用0.22?m
的一次性过滤器过滤除菌，分装成1ml小份，储存于-200C。
实验方法（以?-互补法为例）：
1． 在一事先制备好的含相应抗生素的琼脂平板上加40?lX-gal储存液和4?l异丙
基硫代-?-D-半乳糖苷（IPTG）溶液（浓度为200mg/ml）。
2． 用无菌玻璃涂布器把溶液涂布于整个平板的表面，于370C培养直至所有的液
体消失。由于二甲基甲酰胺挥发度低，如使用新制备的平板则需要3-4小时。 3． 将待检细菌接种到平板上，可用接种环或牙签划线接种，也可将100?l细菌
悬液涂布在琼脂培养表面。接种物吸收后，倒置平板于370C培养12-16小时。 4． 于40C将平板放置数小时，使蓝色充分显色。带有?-半乳糖苷酶活性蛋白菌
落中间为蓝色，外周为深蓝色。白色菌落偶尔也在中央出现一个淡蓝色斑点，但其外周无色。
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第四章
SDS－PAGE检测蛋白
实验十一：蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳
目的：掌握SDS-PAGE的基本原理，学会使用该方法来分析所表达的蛋白质，蛋白质大小、形状和所带电荷不同，在SDS-PAGE中的迁移率就不同，因此可采用该方法来推算所表达的蛋白质的分子量。
原理：聚丙烯酰胺，即丙烯酰胺和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺，在催化剂过硫酸铵作用下聚合形成凝胶。反应液中还加有四甲基乙二胺用来引发和控制聚合反应。反应混合物在底部用1.5%琼脂封闭，反应液顶覆盖一层水层，保证凝胶表面平坦，同时起到隔离大气中氧气的作用，因为氧气可抑制聚合反应。
在蛋白质溶液中加入SDS，这种阴离子去污剂能够与蛋白质相结合，破坏蛋白质内部、分子之间以及其他物质的非共价键，使蛋白质变性而破坏原有的空间构象。按照1.4gSDS/1g蛋白质结合，形成SDS-蛋白质复合物。由于SDS带负电，使各种蛋白质的SDS-多肽复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种类的蛋白质原有的电荷差别；同时，不同蛋白质的SDS复合物形状也相似，都呈长椭圆形。因此，在自由电泳时，它们的泳动率基本相同，而在某一适宜浓度的聚丙烯酰胺凝胶电泳介质中电泳时，由于凝胶的分子筛作用，电泳迁移率就取决于蛋白质-SDS复合物的大小，也可以说是取决于蛋白质分子量的大小。
根据经验得知，当蛋白质分子量在11.7-165KD之间时，蛋白质-SDS复合物的
电泳迁移率与蛋白质分子量的对数成线性关系，符合直线方程式；lgMW=-bX+K（MW为蛋白质的分子量，X为蛋白质-SDS复合物电泳的相对迁移率，K和b均为常数），将已知分子量的标准蛋白质在SDS-PAGE中电泳迁移率对分子量的对数作图，即可得到一条标准曲线。只要测得未知分子量的蛋白质在相同条件下的电泳迁移率，就能根据标准曲线求得其分子量。
仪器与主要试剂： 1. 主要器材：
电泳仪、垂直电泳仪、进样器、镊子、注射器、烧杯、旋涡器、离心机 2. 主要试剂： （1） （2） （3）
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低分子量标准蛋白质液10?l； 菌体培养液一支1.5ml；
2×蛋白质样品缓冲液，组成如下：
Tris β-巯基乙醇 溴酚蓝 甘油 SDS 蒸馏水
3. 试剂
30%丙烯酰胺 10%过硫酸铵 TEMED 上胶缓冲液 下胶缓冲液
0.15g 1.0ml 0.02g 2.0ml 0.4g 7.0ml
称29g丙烯酰胺，1g甲叉丙烯酰胺，溶于蒸馏水并定容至100ml，滤纸过滤后置棕色玻璃瓶内室温保存 1g过硫酸铵溶于蒸馏水定容至10ml N，N，N’，N’-四甲基乙二胺，棕色瓶保存
Tris12.1g， SDS0.4g溶于60ml蒸馏水，用盐酸调pH6.8，定容至100ml
Tris12.1g， SDS0.4g溶于60ml蒸馏水，用盐酸调pH8.8，定容至100ml
1×甘氨酸电泳缓冲液 25mmol/L Tris（3.02g），250mmol/L 甘氨酸（18.8g），
0.1%SDS（1g）
染色液 脱色液
实验方法： 1. 安装电泳槽
先将二块玻璃板洗干净，干燥，嵌入胶带的凹槽中，装在电极槽上，拧紧外螺丝，使其夹紧（不能过紧以防玻璃破裂）。为避免制胶时胶液由狭缝漏掉，灌胶时可先在槽底部和两边用溶化的1%琼脂封闭，使其液面高度与外挡板一致，待琼脂凝固后再配制聚丙烯酰胺分离胶（下胶）。 2. 凝胶的制备
由冰箱中取出储液平衡到室温后开始配胶，在50ml烧杯内按下列配方配制：
10%SDS-PAGE配方 30%丙烯酰胺
缓冲液
H20
10%过硫酸铵 TEMED 总体积
17
17
ml ml ml ?l ?l ml 下胶10% 6.67 4.25 5.89 120
上胶4% 0.65 1.25 3.04 50 5 5
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0.5g考马斯亮蓝R250，90ml甲醇，20ml冰乙酸，加水至200ml
与染色液成分相似，无考马斯亮蓝R250
3. 灌胶
迅速将配好的丙烯酰胺溶液灌入两片玻璃板的间隙中，留出灌注浓缩胶所需的空间（梳子齿长再加1厘米），用细管小心地在丙烯酰胺溶液上覆盖上一层蒸馏水，防止因氧气扩散进入凝胶而抑制聚合反应。待分离胶聚合完全后（约30min），倾出覆盖水层。
再按上表配置4%浓缩胶（上胶）立即混合，在已聚合的分离胶上直接灌注后，立即在上胶溶液中插入干净的Teflon梳子，两边平直，小心避免气泡混入，将凝胶垂直放置于室温下10-15min，待浓缩胶凝固后，将梳子小心拔出，然后用水冲洗加样槽以除去未聚合的丙烯酰胺，用针头把加样槽之间的胶齿弄直，并在电泳槽内加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液。 4. 样品处理 （1）
待测蛋白质样品处理
经37℃培养过夜的大肠杆菌菌液1.5ml， 6000rpm离心10min，弃上清加入TE缓冲液（0.1molTris，10mmol/L EDTA）50?l，将菌体再旋涡器悬浮，再加入2×样品缓冲液50?l混匀，在100℃水浴中煮沸5min。 （2）
标准蛋白质样品的处理
将已分装好的10?l标准蛋白质样品中加入10?l样品缓冲液，混匀，在100℃水浴中煮沸5min。 5. 加样
待样品冷却后，用微量进样器（接上小吸管），吸取30-40?l样品，按号依次加入样品槽，因样品液内有甘油，可使样品沉降在凝胶面上。 6. 电泳
加样完毕，将前槽接负极，后槽接正极，打开直流电源，先把电压调至8v/cm（80v），待染料前沿进入分离胶成狭窄带时，将电压提高到12v/cm（120v），电泳4-6h后，直到溴酚蓝指示剂迁移到接近凝胶底部时立即停止电泳。 7. 剥胶
从电泳槽上卸下凝胶板，放置在纸巾上，用刮勺撬开玻璃板。 8. 染色以及脱色
将电泳后的凝胶板轻轻取下，放入染色液中染色，约1h后，把染色液倒回瓶中，加入脱色液，脱色4-8h，其间更换脱色液3-4次。可将凝胶浸于水中或固定在20%甘油中或抽干，干燥后成胶片保存或拍照。 五、蛋白质分子量计算
电泳迁移率的计算：
按下列公式计算蛋白质样品的相对迁移率（MR）
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