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程为非线性色谱。
不同浓度的溶质洗脱时间不同，会出现拖尾现象或前导现象。
2. 理论板模型认为溶质的分配平衡不能在瞬间完成，而需要一定的样高，在此柱之内，溶质在两相间达到平衡。通常将溶质达到一次平衡的层析柱段成为一个理论板，该柱段的高度称为理论当量高度（HELP）。 理论塔板数越多，洗脱峰越窄，柱效越高，溶质之间的分离度越好。 3.传质速率模型：
传质速率模型考虑了溶质在流动相和固定相间的传质速率以及流动相的流动状态，确定色谱分离性能的影响因素。 = HETP u
A
+B+Cu A、B、C：常数，与速度无关。A为分子扩散（纵向扩散）系数，B为涡流扩散项 C为传质阻力系数
在液相色谱中，分子在液相中的扩散系数要小得多，因此A项可忽略不计 在气象色谱中，分子在气相中的扩散系数很大，因此A项不可忽略
B项是与填充物颗粒有关的项，粒度越小，越均匀，可以减少涡流扩散，降低HETP，提高理论板数
C项也是与填充物颗粒有关的项，与粒度直径平方成正比，通过降低流速与采用小的固定相粒径，可以较少传质阻力，从而降低HETP，提高理论板数
降低流速意味着增加分离时间，故采用细粒径的方法可以同时保证分离操作的高速度和高精度，这是高效液相色谱的理论基础。
3. 试描述色谱传质速率模型中范第姆特（van Deemter）方程的一般形式，并根据方程说明如何降低液相色谱的HETP，提高分离效率。 A
HETP = u
+B+Cu A、B、C：常数，与速度无关。A为分子扩散（纵向扩散）系数，B为涡流扩散项 C为传质阻力系数
在液相色谱中，分子在液相中的扩散系数要小得多，因此A项可忽略不计 在气象色谱中，分子在气相中的扩散系数很大，因此A项不可忽略
B项是与填充物颗粒有关的项，粒度越小，越均匀，可以减少涡流扩散，降低HETP，提高理论板数
C项也是与填充物颗粒有关的项，与粒度直径平方成正比，通过降低流速与采用小的固定相粒径，可以较少传质阻力，从而降低HETP，提高理论板数
降低流速意味着增加分离时间，故采用细粒径的方法可以同时保证分离操作的高速度和高精度，这是高效液相色谱的理论基础。
第七章 色谱 （下）
一、 名词解释
凝胶过滤色谱：凝胶过滤色谱利用凝胶粒子（通常称为凝胶过滤介质）为固定相，是根据料液中溶质相对分子质量
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的差别进行分离的液相色谱法。
溶胀率：干燥凝胶颗粒使用前要用水溶液进行溶胀处理，溶胀后每克干凝胶所吸收的水分的百分数成为溶胀率。即溶胀率=100%×（ 溶胀处理平衡后重量-干燥重量）/干燥重量。
床体积：凝胶干粉的窗体积是指1g干胶粉充分溶胀后所占有的体积。可用于估算装满一定体积的色谱柱所需的凝胶干粉量。
排阻极限：凝胶过滤介质的排阻极限是指不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的相对分子质量。 分级范围：即能为凝胶阻滞并且相互之间可以得到分离的溶质的相对分子质量范围。
离子交换色谱：离子交换色谱利用离子交换剂为固定相，是根据荷电介质与离子交换剂之间静电相互作用力的差别进行溶质分离的洗脱色谱法。
反相色谱：利用表面非极性的反相介质为固定相，极性有机溶剂的水溶液为流动相，是根据溶质极性（疏水性）的差别进行分离纯化的洗脱色谱法。
ODS柱：一种常用的反相色谱柱。固定相，常用十八烷基(ODS)键合相，因此称为ODS柱
也叫C18柱。它是长链烷基键合相，有较高的碳含量和更好的疏水性，对各种类型的生物大分子有更强的适应能力。 疏水作用色谱：利用表面偶联弱疏水性集团（疏水性配基）的疏水性吸附剂为固定相，是根据蛋白质与疏水性吸附剂之间的弱疏水性相互作用的差别进行蛋白质类生物大分子分离纯化的洗脱色谱法。 疏水性吸附剂：各种凝胶过滤介质经偶联疏水性配基后均可用作疏水性吸附剂。
亲和色谱：是利用亲和吸附作用分离纯化生物物质的液相色谱法。亲和色谱的固定相是键合亲和配基的亲和吸附介质（亲和吸附剂）。
亲和吸附剂：将亲和配基共价偶联在固体粒子（配基的载体）的表面（孔内）即可制备亲和吸附剂。亲和吸附剂又称亲和载体。 二、填空题
1. 凝胶色谱是以__________的__________结构的凝胶颗粒作为固定相，根据物质的____________进行分离的一种
色谱分离技术。
2. 凝胶色谱按其流动相的不同分为____________和__________________。
3. 凝胶色谱柱的总体积分为3个部分，即为____________、_____________和____________。在凝胶色谱中，分
配系数Kd表示 ，Kd=1意味着 ，Kd=0意味着 ，0 4. 凝胶一般为球形，其 对分离度有重要影响。其越小，HETP ，分离效率 。 5. 凝胶过滤色谱的主要用途有____________、_____________和____________。 6. 凝胶色谱柱的外水体积可以用 来测定。 7. 凝胶过滤色谱常用的凝胶有 和 。 8. GFC一般采用 方式进行洗脱展开，这种洗脱法称 。 9. 离子交换色谱是以 为固定相，根据_____________________而进行分离的一种色谱分离技术。适合于 ____________________物质的分离。 10. 在离子交换色谱中，线性梯度洗脱过程中，流动相的离子强度线性增大，因此溶质的分配系数_________，移 动速度__________。 33 A 11. 在IEC中多采用 洗脱和 洗脱操作。m(I)?B12. 在离子交换色谱中，分配系数与离子强度关系为 I ，B为溶质的 和离子交换基团的 的比值，由于蛋白质等生物大分子为多价电解质，在pH值偏离 等电点的溶液中B值比较 。 ?m?13. 在同一离子强度下，不同蛋白质的 可相差非常 ，因此，离子色谱多采用离子强度 的 洗脱法，或离子强度 的 洗脱法。 14. 反相色谱是利用 为固定相， 为流动相，是根据 进行分离的洗脱色谱法。 15. RPC固定相表面完全被___ ____基团所覆盖，表现强烈的_________,因此，必须采用______有机溶剂（如甲 醇、乙腈等）或_________进行溶质的洗脱分离。 16. RPC主要用于相对分子质量低于_________，特别是________以下的 小分子物质的分析和纯化。 17. 溶质在反向介质上的分配系数取决于溶质的疏水性，一般疏水性越大，分配系数越_______。 18. 反相色谱中流动相的极性越大，洗脱能力_________，溶质的分配系数______ __。通常采用 流 动极性，也即是 有机溶剂比例的梯度洗脱方式。 19. 反相色谱中，硅烷化反应的转化率只能达到约 ，一般应用于弱极性到 的小分子物质的分离和纯化。 20. 反相色谱中，最常用的反相介质为 和 。 21. 反相色谱用于的蛋白质分离时，其固定相要采用 基质，流动相常用_________而不 用 。 22. 疏水作用色谱利用表面偶联 吸附剂为固定相，是根据 与 之间 疏水性相互 作用的差别进行蛋白类生物大分子分离纯化的方法。 23. 疏水性吸附剂由 经偶联弱疏水性配基而成。常用的疏水性配基有 和 等。 24. 在离子强度______的盐溶液中，蛋白质表面疏水部位的水化层被破坏，蛋白质的__________作用增大。疏水性 相互作用色谱的蛋白质吸附需在 浓度盐溶液中进行，然后逐渐 流动相离子强度进行洗脱。 25. 疏水性吸附与一般吸附_________，吸附结合作用随温度升高而 。 26. HIC（疏水性相互作用层析）主要采用 流动相离子强度的线性梯度洗脱法和逐次洗脱法；IEC（离子交 换层析）主要采用 流动相离子强度的线性梯度洗脱法和逐次洗脱法。 27. 在HIC中，有时为帮助蛋白质的洗脱，会在流动相中添加 、 和 等。 28. 具有亲和作用的分子（物质）对之间具有“钥锁”的关系是产生亲和作用的__ ___条件，但并不是___ __。 29. 亲和层析利用______ ___为固定相，可采用 洗脱和 洗脱法。 30. 亲和吸附介质由 、 和 组成。 31. 亲和吸附介质的载体一般采用 介质。 32. 常用的亲和配基有 、 、 、 、 和 等。 33. 亲和分离中常用的亲和关系有抗原和 ，酶和 ，凝集素和 ，免疫球蛋白和 34 等。 34. 结合常数越大，或解离度越小表示亲和结合作用越____________。 35. 一般的亲和色谱操作分为 、 、 和 四个步骤。 36. 亲和色谱多采用普通洗脱法，即通过 、 、 以及 来进行。 三、选择题 1.GFC中溶质的分配系数在分级范围内随相对分子质量的对数值增大而___B___。 A.线性增大 B.线性减少 C.急剧增大 D.急剧减少 2.凝胶的分级范围越小，则分离度 _A___ 。 A.越大 B.越小 C.小于1 D.小于0 3. 凝胶层析分离混合物的基本原理是（ B ） A.吸附力差异 B.分子筛作用 C.离子交换 D.配体亲和差异 4.葡聚糖凝胶是传统的凝胶过滤介质，交联度越______，网络结构越紧密。 A.高 B.低 C.不确定 5.具有亲和作用的分子（物质）对之间具有“钥匙”和“锁孔”的关系是产生亲和结合作用的 C 。 A.充分条件 B.充要条件 C.必要条件 D.假设条件 6.如果亲和作用主要源于静电引力，提高离子强度会 B 亲和作用。 A.增加 B.减弱 C.不影响 D.减弱或完全破坏 7.在亲和分离操作中，许多亲和吸附的目标蛋白质用高浓度的盐溶液洗脱，说明 D 在亲和作用中占主要地位。 A.疏水性相互作用 B.配位键 C.非共价键 D.静电力 8. 凝胶过滤色谱是根据料液中溶脂的__A____的差别进行分离的液相色谱法 A.相对分子质量 B.离子数 C.化合价 D.质子数 9. 凝胶过滤介质的交联度越__B____，凝胶的网状结构就越紧密。 A.低 B.高 C.不确定 10. 离子交换色谱利用___B___ 为固定相,是根据荷电溶质与离子交换剂之间静电相互作用力的差别进行分离的洗脱色谱法。 A.凝胶颗粒 B.离子交换剂 D.吸附介质 C.表面非极性反向介质 11. 在离子强度较__C____的盐溶液中，蛋白质表面的疏水部位的水化层被破坏，疏水性相互增大 A.低 B.不确定 C.高 12.在离液离子存在下的疏水性吸附__D____，蛋白质易于洗脱. A.增强 B.不变 C.不确定 D.减弱 13.反相色谱是根据溶质___D___的差别进行分离纯化的洗脱色谱法。 A. 亲水性 B.相对分子质量 C.电荷数 D.疏水性 14. 亲和试剂制备步骤不包括：（ A ） A.试剂的选择 B.载体的选择 35 C.载体的活化 D.配基的连接 15. 常用疏水性吸附剂中常用的疏水性配基不包含哪项（ E ） A.苯基 B.短链烷基 C.烷氨基 D.聚乙二醇和聚醚等 E.烃基 16. 利用层析分离溶质时,Rs需要满足多大要求使得分离较好（ B ） A 1-1.5 B 1.2-1.5 C 0.5-1 D 0.8-1 17. 凝胶吸附层析的基本原理是（A ） A 分子筛效应 B离子交换 Ｃ吸附力差异 D配体亲和差异 18. 用于蛋白质分离过程中的脱盐和更换缓冲液的色谱是（ C ） A 离子交换色谱 B亲和色谱 Ｃ凝胶层析 Ｄ反相色谱 19. 蛋白质的分子量测定可采用（C ） A 离子交换层析 B亲和层析 C 凝胶层析 D 反相色谱 20.下面哪一种是根据酶分子专一结合的纯化方法（ A ） A 亲和层析 B 凝胶层析 C 离子交换层析 Ｄ盐析 21.GFC中溶质的分配系数在分级范围内随相对分子质量的对数值增大而 B 。 A.线性增大 B.线性减少 C.急剧增大 D.急剧减少 22.在IEC线性梯度洗脱过程中，流动相的离子强度线性增大，因此，溶质的 C 连续降低，移动速度逐渐增大。 A.溶解度 B.扩散系数 C.分配系数 D.分离度 23. 在IEC逐次洗脱过程中，流动相的离子强度阶跃增大，溶质的分配系数 B 降低。 A.逐渐 B.阶段式 C.线性 D.急剧 24.一些凝胶过滤介质经偶联疏水性配基后均可用作疏水性吸附剂。下列不能用作疏水性配基的是（ C ）。 A. 苯基 B.短链烷基 C.乙腈 D.聚乙二醇 25.反相色谱（RPC）利用表面（ B ）的反相介质为固定相，( A )有机溶剂的水溶液为流动相,是根据溶质极性的差别进行分离纯化的洗脱色谱法。 A. 极性 B. 非极性 C. 电中性 D. 带电性 26. 反相色谱与其他色谱一样，当固定相一定时，可通过调节流动相的组成调整溶质的分配系数。流动相的极性越 （ A ），洗脱能力越（ A ），溶质的分配系数越（ A ）。 A. 大 弱 大 B. 大 弱 小 C. 小 弱 大 D.大 强 大 27. 不同的分配系数（ D ）不是同一种物质，同一分配系数（ D ）是同一物质。 A.一定 一定 B.不一定 一定C.不一定 不一定D.一定 不一定 28. 凝胶一般为球形，其粒径大小对分离度有重要影响。粒径越小，HETP越小，分辨率越大。软凝胶粒径较大，一 般为（ A ）μm。 A. 50~150 B.5~50 C.46~165 D.20~40 29. 排阻极限是指不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的相对分子质量。即相对分子质量（ A ）该数值的分子（ A ）进入到凝胶网络中，其洗脱体积为V0。 A. 小于 不能 B. 小于 不一定能 C. 大于 不能 D.大于 能 30. 反相色谱中，反相介质中最具代表性的是以硅胶为载体，通过硅烷化反应在硅胶表面键合非极性分子层制备。