新型丙型肝炎病毒Core及NS3抗原的制备(3)

硕士学位论文目录摘要……………………………………………………………………ＩＡＢＳＴＲＡＣＴ……………………………………………………………………………………ｉ１前言………………………………………………………………………………．１月ＩＪ舌………………………………………………………………………………………．１１．１１．２１．３１．４１．５１．６１．７ＨＣＶ流行病学及基因分布………………………………………………１ＨＣＶ基本分子生物学特性………………………………………………３ＨＣＶ诊断………………………………………………………………………………………６ＨＣＶ研究模型……………………………………………………………８慢病毒载体的结构及功能………………………………………………．．８慢病毒载体的应用………………………………………………………．．９本研究的目的和意义……………………………………………………１０２材料……………………………………………………………………………．．１２２．１主要试剂……………………………………………………………………１２２．２菌株、质粒和细胞株………………………………………………………１４２．３引物合成……………………………………………………………………１４２．４主要仪器与耗材……………………………………………………………１５２．５主要溶液配置………………………………………………………………１６３方ｊＩ去……………………………………………………………………………………．．２１３．１携带ＨＣＶＣｏｒｅ和ＮＳ３基因慢病毒载体的构建…………………………２１３．２目的蛋白的瞬时表达与鉴定………………………………………………２９３．３重组慢病毒的包装与测定…………………………………………………３５３．４重组慢病毒转导目的细胞…………………………………………………３８３．５目的蛋白的持续表达与鉴定………………………………………………３９３．６目的蛋白的纯化与鉴定……………………………………………………４ｌ３．７软件……………………………………………………………………………………．．４４目录４结果……………………………………………………………………………………．．４５４．１成功构建ｐＨＡＧＥ—ｆｕｌｌＥＦｌａ．Ｃｏｒｅ／ＮＳ３．ＭＣＳ．ＩＺｓＧ－ｒｅｅｎ载体……………．４５４．２目的蛋白的瞬时表达………………………………………………………４８４．３重组慢病毒滴度的测定……………………………………………………５０４．４重组慢病毒转导目的细胞后目的蛋白的表达与鉴定……………………５１４．５目的蛋白的纯化与鉴定……………………………………………………５５５讨论……………………………………………………………………………………．．６０总结…………………………………………………………………………………………６３皇Ｆ｜…………………………………………………………………………………………，Ｃ■、参考文献…………………………………………………………………６４附录………………………………………．…………………………．６９缩略词表………………………………………………………………．．７２攻读学位期间成果……………………………………………………．．７４致谢…………………………………………………………………………………………７５南方医科大学学位论文原创性声明…………………………………．．７６硕士学位论文１前言丙型肝炎病毒（ＨｅｐａｔｉｔｉｓＣＶｉｒｕｓ，ＨＣＶ）是由Ｃｈｏｏ等人在１９８９年首次从黑猩猩血液中分离到的一种非甲非乙型肝炎病毒［１】，后命名为丙型肝炎病毒，归属于黄病毒科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ），肝病毒属（Ｈｅｐａｃｉｖｉｒｕｓ）。ＨＣＶ主要经血液传播，可引起急慢性肝炎。全球各地ＨＣＶ感染流行状况差异较大，以发展中国家最为严重。据ＷＨＯ报告，目前全世界范围内，大约有１．８亿人感染了丙型肝炎病毒；每年新感染３００—４００万例【２，３】，死亡２５万例，占所有传染病死因的第十位，ＨＣＶ感染者发病隐匿，感染者在相当长时间内是隐蔽的传染源，其中１０—５０％进一步发展为慢性进行性肝病，１－２３％发展为肝癌（ＨＣＣ），并有４—１５％的人死于肝脏相关疾病【４—６】。由于ＨＣＶ基因组在序列上有高度的异质性，不同的分离株在全基因序列上差异达３５％，以至于目前对于ＨＣＶ的诊断和治疗都依然存在很大困难，成为全球性的研究热点。目前对丙型肝炎病毒感染者的筛查仍缺乏十分有效的快速诊断试剂。数据显示，我国献血者ＨＣＶ感染筛查使用的两遍Ｅｌｉｓａ检测方法符合率仅在５０％左右，假阳性率高达３０％，对献血者队伍造成极大损害。当前检查方法使用的抗原为重组大肠杆菌表达的ｃｏｒｅ、ＮＳ３、ＮＳ４和ＮＳ５等抗原，存在反应性弱、非特性强的不足，严重影响了ＨＣｖ抗体检测的准确性。随着对ＨＣＶ研究的不断深入，取得了很多备受关注的研究成果。结合本课题的研究内容，现从以下几个方面对ＨＣＶ作以综述。１．１１．１．１ＨＣＶ流行病学及基因分布ＨＣＶ流行病学丙型病毒性肝炎的是一项全球公共健康问题，据世界卫生组织统计，截至２０１０年，全球ＨＣＶ感染率约为３％，即约１．８亿人感染了ＨＣＶ，每年新发丙型肝炎病例约３．４万例［２，３】。根据２００４年的流行病学调查，我国ＨＣＶ的感染率达到３．２％，即仅在中国，就有约４千万名ＨＣＶ感染者，是ＨＣＶ感染的高流行区前言【９］。大多数ＨＣＶ急性感染者症状轻微，但他们之中会有５５％～８５％发展为慢性肝炎【１０一１２］，５～２５％的慢性感染者将在２５－３０年左右发展成肝硬化［６，Ｌ３］，并且每年又有约１－－４％的人发展为肝癌（ＨＣＣ）ｆ１０】。因此，ＨＣＶ的感染是引起肝硬化和肝癌的一个主要原因。ＨＣＶ的快速传播途径主要为输血或者不规范药物注射［１４】。以献血为主要收入来源的人群为ＨＣＶ感染的高危人群［１５］。因此，建立对献血人群ＨＣＶ感染者的快速准确筛查显得尤为重要。１。１．２ＦＩＣＶ基因分布ＨＣＶ病毒基因组序列具有高度的多态性，主要可分为１１种不同的基因型，７０多种亚型［１６１，其中最常见的亚型为Ｉａ，１ｂ，２ａ，２ｂ和３ａ［１７，１８１，主要分布在美国，欧洲，澳大利亚和东亚（日本，中国和泰国），其他亚型的地域性更为有限，如４ａ主要分布在中东，埃及和非洲中部，５ａ主要分布在南美，６ａ主要分布在南亚［１９１。我国感染ＨＣＶ主要以ｌｂ和２ａ型常见，特别是ｌｂ型，约占整人群的７０％［２０１。大多数基因１型ＨＣＶ感染者都有１０．２０年的感染史，且１ｂ基因型的ＨＣＶ感染者患肝癌的风险相比于其他ＨＣＶ亚型的感染者更高［２１】，且Ｉｂ型ＨＣＶ完整结构蛋白基因序列与现有基因型１ａ、ｌｂ、２ａ、２ｂ、３、４、５和６型丙型肝炎病毒之间的核苷酸序列同源性为６９．１％。硕士学位论文圈１ＨＣＶ基因型全球分布图【２２】ＦｉｇＩＨｅｐａｔｉｔｉｓＣｖｉｒｕｓｐｒｅｖａｌｅｎｃｅａｍｏｎｇａｄｕｌｔｓａｎｄｇｅｎｏｔｙｐｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ１．２１．２．ＩＨＣＶ基本分子生物学特性ＨＣＶ形态ＨＣＶ是一种非甲非乙型肝炎病毒，后命名为丙型肝炎病毒．归属于肝炎病毒属（Ｈｅｐａｃｉｖｉｒｕｓ），黄病毒科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）。ＨＣＶ病毒体呈球形，直径小于８０ｍｎ（在肝细胞中为３６～４０ｎｍ。在血液中为３６．６２ｎｍ），核衣壳外包绕含脂质的囊膜，囊膜上有刺突。ＨＣＶ为单股正链ＲＮＡ病毒。ＨＣＶ的ＲＮＡ全长约为９６ｋｂ，包括一个位于基因中央的开放阅读框（ＯＲＦ）。该阅读框编码３０００多个氨基酸的前体多聚蛋白，通过宿主和病毒的蛋白酶作用被切割成１０个具有独立功能的ＨＣＶ蛋白，根据功能的不同分别命名为核心蛋白Ｃｏｒｅ．包膜蛋白Ｅｌ、Ｅ２，ｐ７和非结构蛋白（Ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｐｒｏｔｅｉｎ）ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ和ＮＳＳＢ［２３］。１．２．２ＨＣＶ基因结构ＨＣＶＲＮＡ全长约９．６ｋｂ，５’和３’非编码区（ＮＣＲ）分别有３１９—３４１ｂＤ，和２７．５５ｂｐ，含有几个顺向和反向重复序列。５’ＵＴＲ是ＨＣＶ基因组中最为保守的