横坐标为reads的碱基位置，纵坐标为单碱基所占的比例；不同颜色代表不同的碱基类型
2.3 测序数据过滤
测序得到的原始测序序列，里面含有带接头的、低质量的reads，为了保证信息分析质量，必须对raw reads进行过滤，得到clean reads，后续分析都基于clean reads。
数据处理的步骤如下：
(1) 去除带接头(adapter)的reads；
(2) 去除N(N表示无法确定碱基信息)的比例大于10%的reads； (3) 去除低质量reads。
RNA-seq 的接头(Adapter, Oligonucleotide sequences for TruSeqTM RNA and DNA Sample Prep Kits) 信息：
RNA 5’ Adapter (RA5), part # 15013205：
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’ RNA 3’ Adapter (RA3), part # 15013207： 5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC(6位index)ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’
图2.3 原始数据过滤结果
2.4 测序数据质量情况汇总
表2.4 数据产出质量情况一览表
Sample name Raw reads Clean reads clean bases Error rate(%) Q20(%) Q30(%) GC content(%) HS1_1 HS1_2 HS2_1 36579608 36579608 36547734 35175205 35175205 35119463 3.52G 3.52G 3.51G 0.03 0.03 0.03 97.88 96.50 97.85 92.88 90.38 92.81 49.39 49.59 49.53 数据质量情况详细内容如下：
(1) Raw reads：统计原始序列数据，以四行为一个单位，统计每个文件的测序序列的个数。
(2) Clean reads：计算方法同 Raw Reads，只是统计的文件为过滤后的测序数据。后续的生物信息分析都是基于Clean reads。
(3) Clean bases：测序序列的个数乘以测序序列的长度，并转化为以G为单位。
(4) Error rate：通过公式1计算得到。 (5) Q20、Q30：分别计算 Phred 数值大于20、30的碱基占总体碱基的百分比。
(6) GC content：计算碱基G和C的数量总和占总的碱基数量的百分比。
3 参考序列比对分析
测序序列定位算法：根据不同的基因组的特征，我们选取相对合适的软件(动植物用TopHat(Trapnell et al., 2009)、真菌或者基因密度较高的物种用Bowtie)，合适的参数设置(如最大的内含子长度，会根据已知的该物种的基因模型来进行统计分析)，将过滤后的测序序列进行基因组定位分析。下图为TopHat的算法示意图：
Tophat的算法主要分为两个部分：
(1) 将测序序列整段比对到外显子上。 (2) 将测序序列分段比对到两个外显子上。
我们统计了实验所产生的测序序列的定位个数(Total Mapped Reads)及其占clean reads的百分比，其中包括多个定位的测序序列个数(Multiple Mapped Reads)及其占总体（clean reads）的百分比，以及单个定位的测序序列个数(Uniquely Mapped Reads)及其占总体（clean reads）的百分比。 3.1 Reads与参考基因组比对情况统计
表3.1 Reads与参考基因组比对情况一览表
Sample name Total reads Total mapped Multiple mapped Uniquely mapped Read-1 Read-2 Reads map to '+' Reads map to '-' Non-splice reads Splice reads Reads mapped in proper pairs HS1 70350410 60529821 (86.04%) 606556 (0.86%) 59923265 (85.18%) 30176973 (42.9%) 29746292 (42.28%) 29930036 (42.54%) 29993229 (42.63%) 42357242 (60.21%) 17566023 (24.97%) 53795182 (76.47%) HS2 70238926 60232484 (85.75%) 633575 (0.9%) 59598909 (84.85%) 29987004 (42.69%) 29611905 (42.16%) 29783311 (42.4%) 29815598 (42.45%) 42528691 (60.55%) 17070218 (24.3%) 54428240 (77.49%) HT1 76161678 63555439 (83.45%) 714678 (0.94%) 62840761 (82.51%) 31592931 (41.48%) 31247830 (41.03%) 31409912 (41.24%) 31430849 (41.27%) 45227757 (59.38%) 17613004 (23.13%) 56181352 (73.77%) HT2 50666084 43461327 (85.78%) 450156 (0.89%) 43011171 (84.89%) 21654629 (42.74%) 21356542 (42.15%) 21476601 (42.39%) 21534570 (42.5%) 31347392 (61.87%) 11663779 (23.02%) 38524314 (76.04%) HW1 46573662 40246848 (86.42%) 389470 (0.84%) 39857378 (85.58%) 20028779 (43%) 19828599 (42.57%) 19923501 (42.78%) 19933877 (42.8%) 28062847 (60.25%) 11794531 (25.32%) 36101400 (77.51%) HW2 40543118 34971284 (86.26%) 335509 (0.83%) 34635775 (85.37%) 17411209 (43.02%) 17224566 (42.35%) 17289330 (42.61%) 17346445 (42.76%) 24725216 (61.1%) 9910559 (24.26%) 31246362 (77.25%) 比对结果统计详细内容如下：
(1) Total reads：测序序列经过测序数据过滤后的数量统计(Clean data)。 (2) Total mapped：能定位到基因组上的测序序列的数量的统计；一般情况下，如果不存在污染并且参考基因组选择合适的情况下，这部分数据的百分比大于 70%。
(3) Multiple mapped：在参考序列上有多个比对位置的测序序列的数量统计；这部分数据的百分比一般会小于10%。
(4) Uniquely mapped：在参考序列上有唯一比对位置的测序序列的数量统
计。
(5) Reads map to '+'，Reads map to '-'：测序序列比对到基因组上正链和负链的统计。
(6) Splice reads：(2)中，分段比对到两个外显子上的测序序列(也称为Junction reads)的统计，Non-splice reads为整段比对到外显子的将测序序列的统计，Splice reads的百分比取决于测序片段的长度。 3.2 Reads在参考基因组不同区域的分布情况
对Total mapped reads的比对到基因组上的各个部分的情况进行统计，定位区域分为Exon(外显子)、Intron(内含子)和Intergenic(基因间隔区域)。 正常情况下，Exon (外显子)区域的测序序列定位的百分比含量应该最高，定位到Intron (内含子) 区域的测序序列可能是由于非成熟的mRNA的污染或者基因组注释不完全导致的，而定位到Intergenic(基因间隔区域)的测序序列可能是因为基因组注释不完全以及背景噪音。