高压液相色谱(HPLC)基本概念和理论(2)

2019-05-17 15:19

理论塔板数(theoretical plate number,N)--用于定量表示色谱柱的分离效率(简称柱效)。

N取决于固定相的种类、性质(粒度、粒径分布等)、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。在一张多组分色谱图上,如果各组分含量相当,则后洗脱的峰比前面的峰要逐渐加宽,峰高则逐渐降低。

用半峰宽计算理论塔数比用峰宽计算更为方便和常用,因为半峰宽更易准确测定,尤其是对稍有拖尾的峰。

N与柱长成正比,柱越长,N越大。用N表示柱效时应注明柱长,如果未注明,则表示柱长为1米时的理论塔板数。(一般HPLC柱的N在1000以上。)

若用调整保留时间(t’R)计算理论塔板数,所得值称为有效理论塔板数(N有效或Neff)。

理论塔板高度(theoretical plate height,H)--每单位柱长的方差。实际应用时往往用柱长L和理论塔板数计算。

4.相平衡参数

分配系数(distribution coefficient,K)--在一定温度下,化合物在两相间达到分配平衡时,在固定相与流动相中的浓度之比。

分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有关,也与温度、压力有关。在不同的色谱分离机制中,K有不同的概念:吸附色谱法为吸附系数,离子交换

色谱法为选择性系数(或称交换系数),凝胶色谱法为渗透参数。但一般情况可用分配系数来表示。 在条件(流动相、固定相、温度和压力等)一定,样品浓度很低时(Cs、Cm很小)时,K只取决于组分的性质,而与浓度无关。这只是理想状态下的色谱条件,在这种条件下,得到的色谱峰为正常峰;在许多情况下,随着浓度的增大,K减小,这时色谱峰为拖尾峰;而有时随着溶质浓度增大,K也增大,这时色谱峰为前延峰。因此,只有尽可能减少进样量,使组分在柱内浓度降低,K恒定时,才能获得正常峰。 在同一色谱条件下,样品中K值大的组分在固定相中滞留时间长,后流出色谱柱;K值小的组分则滞留时间短,先流出色谱柱。混合物中各组分的分配系数

相差越大,越容易分离,因此混合物中各组分的分配系数不同是色谱分离的前提。

在HPLC中,固定相确定后,K主要受流动相的性质影响。实践中主要靠调整流动相的组成配比及pH值,以获得组分间的分配系数差异及适宜的保留时间,达到分离的目的。

容量因子(capacity factor,k)--化合物在两相间达到分配平衡时,在固定相与流动相中的量之比。因此容量因子也称质量分配系数。

容量因子的物理意义:表示一个组分在固定相中停留的时间(t’R)是不保留组分保留时间(t0)的几倍。k=0时,化合物全部存在于流动相中,在固定相中不保留,t’R=0;k越大,说明固定相对此组分的容量越大,出柱慢,保留时间越长。

容量因子与分配系数的不同点是:K取决于组分、流动相、固定相的性质及温度,而与体积Vs、Vm无关;k除了与性质及温度有关外,还与Vs、Vm有关。由于t’R、t0较Vs、Vm易于测定,所以容量因子比分配系数应用更广泛。

选择性因子(selectivity factor,α)--相邻两组分的分配系数或容量因子之比。α又称为相对保留时间(《美国药典》)。

要使两组分得到分离,必须使α≠1。α与化合物在固定相和流动相中的分配性质、柱温有关,与柱尺寸、流速、填充情况无关。从本质上来说,α的大小表示两组分在两相间的平衡分配热力学性质的差异,即分子间相互作用力的差异。 5.分离参数


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