2.4.2 间接计数法
间接计数法主要用于穿过细胞过多，而无法通过计数获得准确的细胞数所采用的方法，与常用的MTT实验是同样的原 理。 2.4.2.1 MTT法
②?? 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞
② 24孔板中加入500μl含0.5mg/ml MTT的完全培养基，将小室置于其中，使膜浸没在培养基中，37℃ 4h后取出。
③ 24孔板中加入500μl DMSO，将小室置于其中，使膜浸没在DMSO中，振荡10min，使甲湃充分溶解。取出小室，24孔板于酶标仪上测OD值。 2.4.2.2 荧光试剂检测 这类方法一般是与Transwell小室一起出售的，其原理与MTT法类似，是用一种荧光染料染细胞，再将细胞裂解，检测荧光值。Chemicon的ECM554即属于这类。 2.4.2.3 结晶紫检测
上文已说过，这里不再赘述，原理与MTT法也是类似的。但结晶紫染色还有个优点，就是染色和脱色的过程并不影响膜上细胞，在脱色后还可重新染色。 这是用正置显微镜拍摄的图，结晶紫染色，进行细胞计数。
第三节 Transwell的其他应用的实验步骤 1．Transwell肿瘤细胞迁移实验
过程与Transwell侵袭实验基本一致，不同的只是不需要铺Matrigel。个人认为，由于没有基质胶的阻挡，细胞穿过膜的速度较侵袭实验明显加快，所以细胞量要更大。我做侵袭实验的细胞密度是1×105，而迁移实验的密度是1×106。另外，下层培养液的FBS浓度也可适当下调，我做侵袭实验的浓度是5%，迁移实验的浓度是2.5%。 2．cathywxy战友的Transwell上皮细胞培养步骤
做了一段时间的原代细胞培养，把经验拿出来跟大家分享一下吧，请有关战友共同探讨： (1) 将雄性wistar大鼠麻醉，开胸，将气管取出，置于4℃含0.1％胰蛋白酶XIV (Sigma)，100 U/ml青霉素和100ug/ml链霉素（Gibco-BRL）、无Ca 2＋、Mg2＋，无血清的MEM。
(2) 用无菌的细胞刮棒刮气管内壁，将所得溶液离心后得到游离细胞。
(3) 离心后立即用新鲜的上述MEM溶液（含10％胎牛血清）清洗3次，以中和胰蛋白酶，再用含5％胎牛血清、100U/ml 青霉素和100 ug/ml 链霉素的LHC-8 medium (Biofluids)
冲洗一次。
(4) 冲洗过后，将得到的细胞悬液用台盼兰测定活力，若存活率大于90％，则将细胞以106/cm2密度接种于可通透的多聚碳滤膜上（12 mm SNAPWELL, Costar），以37°C 5％CO2-95% 空气含5% 胎牛血清(Gibco-BRL) and 100 U/ml 青霉素and 100ug/ml 链霉素的LHC-8 medium孵育6~10天。
(5) 孵育后，经测定跨上皮电阻在1000~2000Ω之间，即可用于电生理试验。 显微镜下气管上皮细胞形细胞呈铺路石状，圆形核位于中央，生长时常彼此紧密连接成单层细胞片
3. metastasis战友的Transwell B16细胞的体外迁移实验
我以前用 costar的Transwell做过B16细胞的体外迁移实验，具体是这么做的：首先把Transwell倒置，在Transwell的PVPF膜（0.8 um）的下表面涂一层fibronectin(10 ug/ml，50ul),37度2小时，PBS洗一遍后，放入预先每孔加有600ul的培养基（含10%血清）的24孔板内，后在Transwell的内室加入细胞（100ul,用含0.1%血清的培养基稀释好自己所需密度），放入培养箱，12-18小时后，取出Transwell，用棉签擦去PVPF膜靠近内室那一面的细胞，另一面的细胞用甲醛室温固定30分钟，结晶紫染色20分钟，用清水洗3遍以上，后在显微镜下观察细胞，记数。 4．mci战友的内皮细胞HMEC-1迁移实验
1%明胶处理的transwell经无血清的MCDB131培液于培养箱中平衡1小时后，上室加入100μl用serum-free MCDB131稀释的5*104/孔的HMEC及不同浓度的药物，下室加入0.6ml serum-free的MCDB131培液及20üS刺激迁移,同时设置相应阴性及阳性对照，置于CO2培养箱中作用8小时，然后弃去孔中培液，用90%酒精常温固定30分钟，0.1%结晶紫常温染色10分钟，清水漂净，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，显微镜(Olympus, DP50, Japan).下观察并拍照，最后用10%乙酸100μl/孔抽提10分钟，于
600nm处测定OD值。抑制率计算公式为：抑制率（%）=[(OD值给药组-OD值无刺激阴性对照)/（OD值不加药阳性对照- OD值无刺激阴性对照)] ×100%.