分子克隆实验标准步骤
一、
常规分子克隆实验流程：
?确定目的片段的基因序列以及需要插入的载体?引物设计软件或网站设计引物?PCR扩增目的基因片段?PCR产物的回收?载体的酶切?插入片段的酶切（重组不需要酶切）引物设计PCR扩增酶切连接或重组?载体与目的片段的连接或重组?连接或重组产物转化大肠杆菌感受态?涂布平板?平板菌落的鉴定?阳性克隆送测序?测序结果的分析
转化鉴定序列比对
二、 分子克隆实验标准步骤（含实验编号）：
1. PCR扩增目的基因（编号Clone SOP-1）
以本实验室常用酶KOD-Plus-Neo（TOYOBO）为例 体系（50ul）：
10×KOD buf 5ul dNTP(2mM) 5ul
Mg2+ 3ul Primer1 1ul Primer2 1ul Template50-200ng KOD0.5ul
ddH2O up to 50ul
程序： 95℃2min 98℃10s
58℃30s 35cycle 68℃2kb/min 68℃7min 12℃∞
2. PCR产物的琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶的制备（编号Clone SOP-2）
琼脂糖溶液的制备：称取琼脂糖，置于三角瓶中，按1%-1.5%的浓度加入相应体积的TBE或TAE缓液，将该三角瓶置于微波炉加热至琼脂糖溶解。
胶板的制备：①取有机玻璃内槽，洗净、晾干；②将有机玻璃内槽置于一水平位置模具上，安好挡板，放好梳子。在距离底板上放置梳子，以便加入琼脂糖后可以形成完好的加样孔。③将温热琼脂糖溶液倒入胶膜中，使胶液缓慢地展开，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。④室温下静置30min左右，待凝固完全后，轻轻拔出梳子，在胶板上即形成相互隔开的上样孔。制好胶后将铺胶的有机玻璃内槽放在含有0.5～1×TAE（Tris-乙酸）或TBE（Tris-硼酸）工作液的电泳槽中使用，没过胶面1mm以上。
3. 试剂盒回收DNA片段（编号Clone SOP-3）
以本实验室常用DNA凝胶回收试剂盒（天根）为例
使用前请先在漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。
①柱平衡步骤：向吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中）加入500μl平衡液BL，12,000rpm(~13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子）
②将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中，称取重量。
③向胶块中加入等倍体积溶液PN（如果凝胶重为0.1g，其体积可视为100μl，则加入100μlPN溶液），60℃水浴放置，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块，可继续放置几分钟或再补加一些溶胶液，直至胶块完全溶解(若胶块的体积过大，可事先将胶块切成碎块)。
注意：对于回收<300bp的小片段可在加入PN完全溶胶后再加入1/2胶块体积的异丙醇以提高回收率；胶块完全溶解后最好将溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在室温时结合DNA的能力较强。
④将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中），室温放置2min，12,000rpm(~13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。 ⑤向吸附柱CA2中加入600μl漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm(~13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。 ⑥重复操作步骤⑤。
⑦将吸附柱CA2放回收集管中，12,000rpm(~13,400×g)离心2min，尽量除尽漂洗液。将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。
⑧将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB或ddH2O，室温放置2min。12,000rpm(~13,400×g)离心2min收集DNA溶液。
4. 酶切反应（编号Clone SOP-4）
以本实验室常用酶FastDigest restriction enzymes（Thermo）为例 双酶切体系（若是单酶切则只用加一种酶）：
10×FastDigest? buffer or 10×FastDigest? Green buffer 5ul FastDigest restriction enzyme 1 0.5-1ul FastDigest restriction enzyme 2 0.5-1ul DNAN
ddH2Oupto50ul
酶切体系混合均匀后置于37℃条件下反应，反应时间应大于30min，若是载体（2-3ug）至少酶切2小时。
5. 酶切产物的回收（编号Clone SOP-5）
以本实验室常用Axygen?AxyPrep?PCRClean-UpKit（Axygen）为例
①在PCR、酶切、酶标、或测序反应液中，加入3个体积的BufferPCR-A（若BufferPCR-A
不足100ul，加至100ul），混匀后，转移到制备管中，将制备管置于2ml离心管中，12000g离心1min，弃滤液。
②将制备管置回2ml离心管，加700ulBufferW2，12000g离心1min，弃滤液。 ③将制备管置回2ml离心管，加400ulBufferW2，12000g离心1min，弃滤液。
④将制备管置回2ml离心管，12000g离心1min，将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，静置2min。
⑤在制备管中央加25-30ulEluent或ddH2O，室温静置1min，12000g离心1min洗脱DNA。
6. 重组反应（编号Clone SOP-6）
以本实验室常用NovoRec? PCR一步定向克隆试剂盒（Novoprotein）为例 体系：
10×重组缓冲液1ul NovoRec?重组酶0.5ul 线性化载体N 插入片段N ddH2Oupto10ul
注：载体与目的片段的摩尔比在1:3-1:10之间
进行重组反应混匀后在37℃水浴锅中放置20至30分钟后取出置于冰上 立即进行转化
7. 转化（编号Clone SOP-7）
①从-80℃冰箱中取出大肠杆菌感受态细胞，迅速置于冰上缓慢解冻并分装。 ②取出连接产物，加入到分装的感受态中，置于冰上孵育25min
③42℃热激90sec，置于冰上孵育2min，加入700ul，不含抗生素的LB培养基，180rpm37℃培养45min。
④3000rpm离心1min，弃去大部分上清液体，留下约50-100ul，重悬沉淀，滴在已经加入玻璃珠的LB平板（带有相应抗性）上，用玻璃珠涂抹均匀。 ⑤倒出玻璃珠，LB平板置于37℃培养箱，过夜培养。
8. 挑克隆摇菌与菌落PCR检测阳性克隆（编号Clone SOP-8）
①从37℃培养箱中取出过夜培养的平板，用镊子小心镊取高压灭菌后的枪头，以枪头的尖头轻触单个克隆，然后将枪头尖分别在装有有150ulLB液体（带有相应抗性）的1.5mlEP管和菌落PCR反应体系中搅动几下。将装有培养基的EP管37℃220rpm培养3小时。 ②菌落PCR：
20ul菌落PCR体系，以本实验室常用2×TSINGKE Master Mix为例：
2×MIX10ul Primer 10.5ul Primer 20.5ul 菌
ddH2O9ul
菌落PCR程序：
95℃3min 95℃30s
58℃30s30cycle 72℃1-2kb/min 72℃5min 12℃∞
③琼脂糖电泳检测PCR产物以判定阳性克隆
9. 菌液的扩大培养（编号Clone SOP-9）
将PCR鉴定为阳性的菌液吸取5-10ul接种至5mlLB（含抗性）培养基中，在220rpm，37℃摇床中过夜培养。
10. 小提质粒（编号Clone SOP-10）
取出过夜培养的菌液，对已经混浊的菌液进行质粒提取（天根质粒DNA小提试剂盒）。 ①柱平衡步骤：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500μl的平衡液BL，12,000rpm(~13,400×g)离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 ②取5ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，4500rpm离心5分钟，尽量吸除上清，将菌体沉淀收集到一个离心管中。
③向留有菌体沉淀的离心管中加入200μl溶液P1（事先已加入RnaseA）,使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。
④向离心管中加入200μl溶液P2，温和地上下翻转6－8次使菌体充分裂解。
⑤向离心管中加入300μl溶液P3，立即温和地上下翻转6–8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm(~13,400×g)离心10分钟，此时在离心管底部形成沉淀。
注意：P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色可再次离心后取上清。
⑥将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中），注意尽量不要吸出沉淀。12,000rpm(~13,400×g)离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。
⑦向吸附柱CP3中加入600μl漂洗液PW（事先已加入无水乙醇），12,000rpm(~13,400×g)离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。 ⑧向吸附柱CP3中加入600μl漂洗液PW，12,000rpm(~13,400×g)离心30-60秒，倒掉收集管中的废液。
⑨将吸附柱CP3放入收集管中,12,000rpm(~13,400×g)离心2分钟，将吸附柱中残余的漂洗液去除。
⑩将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加80μl洗脱缓冲液EB，室温放置2分钟，12,000rpm(~13,400×g)离心1分钟将质粒溶液收集到离心管中。置于4℃备用。
三、 实验过程注意事项
1. PCR实验请注意酶的扩增效率，有的酶是1kb/min，有的是2kb/min，具体请查看相应酶的说
明书。
2. 琼脂糖凝胶制备过程中请注意污染区与非污染区，在电泳点样前请确保样品和DNA Marker
已加入核酸染料。
3. 试剂盒使用之前检查漂洗液是否已加入无水乙醇。
四、 常用培养基与缓冲液的配制：
1. LB液体培养基（1L）配方：
10g 胰化蛋白胨(Tryptone) 5g 酵母提取物(Yeast extract) 5g NaCl
用去离子水定容至1L，高压蒸汽灭菌20分钟。 2. LB液体培养基（1L）配方：
10g 胰化蛋白胨(Tryptone) 5g 酵母提取物(Yeast extract) 5g NaCl
15g琼脂粉
用去离子水定容至1L，高压蒸汽灭菌20分钟。 3. TB液体培养基（1L）配方：
将下列组分溶解在0.9L水中：蛋白胨 12g，酵母提取物24g，甘油4ml。各组分溶解后高压灭菌。冷却到60℃，再加100ml灭菌的170mmol/L KH2PO4/0.72 mol/L K2HPO4的溶液（2.31g的KH2PO4和12.54gK2HPO4溶在足量的水中，使终体积为100ml，高压灭菌）。 4. 50×TAE电泳缓冲液配方：（工作液为1×）
称取242g Tris溶于800ml双蒸水中，加57.1ml冰乙酸和100ml 0.5mol/L EDTA（pH 8.0），再加水定容至1L，室温保存备用。 5. 5×TBE电泳缓冲液配方：（工作液为0.5×）
称取54g Tris，27.5g硼酸溶于800ml双蒸水中，加入20ml 0.5mol/L EDTA（pH 8.0），再加水定容至1L，室温保存备用。