纳他霉素高产菌株的诱变选育
纳他霉素(Natamycin)是一种多烯大环内酯类抗真菌抗生素，可以抑制各种霉菌、酵母的生 长，也能抑制真菌毒素的产生? 。作为一种安全高效、无毒、广谱的抗真菌剂，已成为食品生物防 腐剂研究领域的一个热点纳他霉素主要由恰塔努加链霉菌(Strepto—myces以口￡ 鲫0 gP\)、纳塔尔链霉菌(Strepto—myces natulonso)和褐黄孢链霉菌(Streptomycesgilvosporeus)等产生菌经发酵过程生产。通过有效地与真菌细胞膜的主要甾醇一麦角固醇结合，破坏细胞膜的选择渗透性使细胞
内的必需物质渗漏而致使菌体死亡【4]。与其他常用的化学防腐剂相比，纳他霉素具有无色无味、对产品的口感特性无影响、适用范围广、使用剂量低、专一性好、安全性高等显著的优势_5 ]。1982年6月，美国FDA正式批准纳他霉素可用作食品防腐剂l7 。1997年3月，中国卫生部正式批准纳他霉素作为食品防腐剂。
随着人们对食品防腐剂安全性认识的提高，纳他霉素的市场需求量会加大。中国的纳他霉素主要通过外企以原料出口，纳他霉素生产企业的发酵水平普遍偏低，成本较高，从而限制了纳他霉素的推广应用。发酵法生产纳他霉素的生产水平与质量和微生物菌种特性、培养基组成、发酵控制手段及产品分离技术密切相关 -lo_，因此，选育具有优良生产特性的菌株对纳他霉素发酵工业具有重要意义。本试验通过对纳他霉素出发菌株紫外线诱变育种，选育稳定高产菌株，为提高纳他霉素的生产水平，降低其使用成本提供理论和技术依据。
褐黄孢链霉菌(Streptomyces gilvosporeusATCC13326)购买于美国菌种保藏中心。无水 葡萄糖、麦芽浸膏、蛋白胨、酵母浸粉购于北京奥特星生物技术有限责任公司，分析纯；琼脂粉购于上海蓝季科技有限公司，生化试剂；甘油、甲醇购于西安化学试剂厂，分析纯；硫酸链霉素购于W()LSEN公司，生化试剂；纳他霉素购于上海奇泓生物有限公司，生化试剂。斜面培养基：葡萄糖lO．0 g、麦芽浸粉3．0 g、酵母粉3．0 g、蛋白胨5．0g、琼脂15．o g，pH 7．0，定容至1 I ；平板活化培养基：葡萄糖10．0 g、麦芽浸粉3．0 g、酵母粉3．0g、蛋白胨5．0 g、琼脂15．0 g、pH 7．0、定容至1L；种子培养基：葡萄糖2O．0 g、蛋白胨6．0 g、酵母粉6．0 g、NaC1 10．0 g、pH 7．0，定容至1 I ；发酵培养基：大豆蛋白分离物20．0 g、葡萄糖40．0g、酵母粉5．0 g、pH 7．0，定容至1 L。恒温培养箱SPX一300B一Ⅱ生化培养箱上海跃进医疗器械厂；紫外分光光度计UV一1700，双光束紫外分光光度计UV一2550日本岛津。
菌种ATCC13326为孢子粉末状，培养前首先活化。无菌状态下取少量ATCC13326孢子粉末接入3mL无菌
生理盐水试管中，震荡均匀。吸取0．1mL孢子悬液涂布接入平板培养基中。28℃倒置培养7 d，供试验使用。
制备孢子悬液取活化的平板菌种，用接种环刮下孢子接人5 mL无菌生理盐水试管中，充分震荡至孢子均匀分散，脱脂棉过滤，收集孢子悬液。在光学显微镜下用血球计数板计数，适当稀释，调整含量为10mI [“]。
取100 L制备好的1O mI 孢子悬液分别涂布于含有不同质量浓度链霉素的平板培养基上，29℃ 培养7～10 d。观察不同平板上的菌落生长情况，记录未长菌落的链霉素最低作用质量浓度，即确定为链霉素对该菌的最小抑制质量浓度。取含量为1OmL 的孢子悬浮液5 mL置直径为70 mm无菌平板中，打开皿盖，在磁力搅拌状态下用紫外灯(波长253．7 nm，功率15 W ，照射距离30 cm)照射，时问分别为10 S、20 S、30 s、40 S、60 s、8O S、100 s和120 S，取不同照射剂量的处理液100 L涂布平板，29℃避光培养7～
10 d，待菌落长出，进行活菌计数。以未经过诱变孢子悬浮液的活菌数为基准，然后以照射时间为横
坐标，存活率为纵坐标，绘制紫外致死曲线。
10 mL 的孢子悬浮液5 mL置直径为70 mm无菌平板中，打开皿盖，选择9O 致死剂量进行紫外照射，即
在磁力搅拌状态下用紫外灯(功率15w，照射距离30 cm)照射35 S。然后取100 I 诱变处理液，涂布于含8
／~g／mI 的链霉素选择培养基平板上，29℃培养10 d，长出的菌落即为链霉素抗性突变株 。将分离得到的链霉素抗性突变菌株单菌落活化并转接斜面保存，29_C避光培养7 d。mL，10 mL 菌株的孢子悬浮液于
25 mI 灭菌的种子培养基中，180 r／min，29℃ 振荡培养26h。再接种2 的种子液于发酵培养液中，180
r／rain，29。C回转式摇床发酵96 h
准确称取0．01 g标准纳他霉素标样，溶于100 mI ===5 冰乙酸的甲醇提取试剂，定容至100 mL，震荡溶解，配成纳他霉素标准母液。分别取0．1、0．2、0．3、0．4、0．5、0．6、0．7、0．8 mL纳他霉素
标准母液，用冰乙酸( 一5 )的甲醇稀释至10 mL，配制成1、2、3、4、5、6、7、8 rng／L的纳他霉素标准溶液，用紫外分光光度计在最大吸收波长303 nm 处测定吸光值，绘制纳他霉素标准曲线。发酵液
纳他霉素定性测定 处理好的发酵液在波长280～340 nm范围内进行扫描，将图谱与0．1 mg／I 的纳他
霉素标准溶液紫外扫描图谱进行对照。以灭菌后的发酵培养基按比例1：9加入5 冰乙酸的甲醇提取试剂，
同发酵液样品处理后做参比溶液进行测定。发酵液中纳他霉素含量的测定 取1．0 mL发酵液于刻度试管中，加入5 冰乙酸的甲醇提取试剂9．0 mL，充分摇匀试样，振荡器充分振荡后10 000 r／min离心15 min，
除去菌丝体及培养基中杂质，所得上清液再用提取试剂适当稀释后即为待测液。用紫外分光光度计在最大
吸收波长303 nm处测定吸光值，在标准曲线上查出对应纳他霉质量浓度，计算发酵液中纳他霉素含量。