产淀粉酶的枯草芽孢杆菌培养基的优化
2 研究内容
2.1 材料与方法
2.1.1 菌种
产α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），实验室内保存。 2.1.2 培养基
(1) 固体斜面培养基：牛肉膏1g、蛋白胨1g、NaCl 0.5g、可溶性淀粉0.5g、琼脂2g，加水到100mL，调节pH至7.0。
(2) 液体种子培养基：牛肉膏1g、蛋白胨1g、NaCl 0.5g、可溶性淀粉0.5g，加水到100mL，调节pH至7.0。
(3) 初始液体发酵培养基：玉米粉5g、豆饼粉4g、磷酸氢二钠0.8g、硫酸铵0.4g、无水氯化钙0.2g，加水到100mL，调节pH至7.0。
(4) 最优液体发酵培养基：蔗糖3%、蛋白胨6%、磷酸氢二钾0.8%、硫酸铵0.4%、无水氯化钙0.2%，pH 7.0。 2.1.3 主要试剂
无水磷酸氢二钠（分析纯，广州鑫镁化工公司）；氯化钠（分析纯，天津化学试剂厂）；苯酸钾（分析纯， 天津化学试剂厂）；碘酸钾（分析纯，天津化学试剂厂）；碘化钾（分析纯，天津化学试剂厂）；硫酸（分析纯，天津化学试剂厂）；结晶紫（分析纯，北京华美生科生物技术有限公司）；95%乙醇（化学纯，天津化学试剂厂）
(1) 基质缓冲液：取无水磷酸氢二钠26.6g、氯化钠1.75g、苯酸钾8.6g、蒸馏水500ml置2000ml烧杯中，加热至沸。先将可溶性淀粉0.4g和冷蒸馏水10ml搅成混悬液，然后将其缓缓倾入已加热的试剂中，边搅边加。再加热至沸1min。待冷却至室温，加蒸馏水1000ml，调节pH至7.0。
(2) 5mol/L碘液：取碘酸钾0.3567g、碘化钾4.5g，蒸馏水800ml搅拌均匀后，缓缓滴加，边搅边加入12mol/L浓硫酸0.9ml。混匀后加蒸馏水至1000ml。配置好的溶液保存在琥珀色瓶中。
(3) 结晶紫染色液：结晶紫1g、95%乙醇20ml、1%草酸铵水溶液80ml，将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。 2.1.4 主要仪器
LDZX-75KBS立式电热压力蒸汽灭菌锅（四川省新德医疗器械有限公司） SHJ系列洁净工作台（上海民仪电子有限公司） LRH系列控温生化培养箱（杭州中拓仪器有限公司）
10
产淀粉酶的枯草芽孢杆菌培养基的优化
FA1004B电子天平（西安超杰生物科技有限公司） KDC-16H高速离心机（广州倍玛特科学仪器有限公司） HZS-H水浴振荡锅（郑州杜甫仪器厂）
台式M295356低速离心机（北京市中西远大科技有限公司） T6新世界紫外可见分光光度计（北京华洋仪器厂） 电子显微镜（成都启跃光电仪器有限公司） 2.1.5 分析测定方法
（一）试验方法
(1) 菌种浓度的确定：选取培养至一定时期的菌液，采用光电比浊计数法，测定菌液的吸光度，以吸光度的大小判断菌种的浓度。
(2) 菌种最佳发酵周期的确定：选取培养至一定时期的发酵液测定发酵产物α-淀粉酶的活力。
(3) 菌种活化培养：斜面试管接种后，将其置于控温生化培养箱内，37℃下培养24小时。
(4) 种子培养：摇床转数为120r/min，种子液摇床培养温度为37℃，装液量为种子液50mL/100mL。
(5) 发酵培养：摇床转数为180r/min，发酵液摇床培养温度为37℃，装液量为发酵液50mL/100mL，接种量为8%。
（二）分析方法
(1) 菌种对数生长期的确定：取培养至一定时间的种子培养液，低速离心除去样品中的少量基质后在660nm处测定其吸光度，以吸光度的大小来判断菌液的浓度，从而断定菌种达到对数生长期的培养时间，或可将菌液用结晶紫染色液染色后，通过在电子显微镜下观察菌种的形态来断定对数长期。
(2) α-淀粉酶活力的测定：取发酵液10mL，7000r/min离心10分钟。取0.1ml的上清液到100ml的锥形瓶中，再加入5ml的基质缓冲液，混匀后于37℃水浴锅中静置反应7.5分钟。取出后加入5ml的5 mmol/L碘液与40ml蒸馏水，混匀后以蒸馏水校零点在660nm处测定吸光度，从而可测得淀粉酶活力（即碘淀粉比色法
[13]
）。酶活力单位的定义为：37℃
下，30min水解10mg淀粉所需要的酶量为1个酶活力单位（u/L）。
淀粉酶活力单位（u/L）=（空白吸光度-测定吸光度）/空白吸光度×8000 （三）单因素实验
在基本培养基中去掉所有的碳源或氮源再分别加入某单一碳、氮源[14]，通过对发酵水平的测定，考察这两个因素对α-淀粉酶活力的影响，从而确定最优的碳、氮源。实验测定后确定这两个因素分别为蔗糖、蛋白胨。
（四）预备试验
11
产淀粉酶的枯草芽孢杆菌培养基的优化
在初始液体发酵培养基的基础上，分别选取蔗糖、蛋白胨为唯一碳、氮源，设计新的含量配比，测定α-淀粉酶活力，从而获得一个粗略的发酵培养基含量组成。
（五）响应面法实验设计
在单因素实验的基础上，根据预备试验确定上下水平后，按二元二次正交旋转组合的设计表确定各试验组的编码与取值[15] 选取蔗糖、蛋白胨为实验因素，其水平编码表见表2-1
表2-1 响应面分析试验因素水平表
Table 1 Test-factor response surface analysis of the level of table
水平（%）
因素 蔗糖 蛋白胨
-1 -0.5 0 0.5 1 2 5
2.5 5.5
3 6
3.5 6.5
4 7
（六）实验流程
菌种活化 ↓
菌种对数生长期的确定
↓
菌种最佳发酵周期的确定
↓
发酵培养基中最佳碳源的确定
↓
发酵培养基中最佳氮源的确定
↓ 预备试验 ↓
响应面法确定最佳浓度配比
↓ 验证试验
2.2 结果与分析
2.2.1 菌种对数生长期的确定
将实验室中冷冻保藏的枯草芽孢杆菌菌种活化后在液体种子培养基中摇瓶培养。分
12
产淀粉酶的枯草芽孢杆菌培养基的优化
别在培养至第4、5、6、7、8、9、10、11、12小时的菌液中取样，并在660nm处测定其吸光度，以菌液的浓度确定菌种达到对数生长期所需的培养时间[16]。由图2-1可以看出，第4个实验号吸光度数值最大，即菌种培养至大约第7小时可达到对数生长期。
菌液OD值0.1000.080OD值0.0600.0400.0200.000024实验号6810
图2-1 菌种对数生长期的确定
Fig.2- 1 Strains to determine the logarithmic phase
注：实验号1-9分别代表培养至第4-12时小的菌液
2.2.2 菌种最佳发酵周期的确定
将培养至对数生长期的种子液以8%的接种量接种到初始液体发酵培养基中进行培养。分别在培养至第12、14、16、18、20、22、24、26、28小时的发酵液中取样，用碘淀粉比色法测定发酵产物α-淀粉酶的活力，以淀粉酶活力的大小确定最佳发酵周期。由图2-2可以看出，第7个实验号数值最大，即发酵培养到大约第24小时时α-淀粉酶活力最大。
图2-2 菌种最佳发酵周期的确定
Fig.2-2 Strains to determine the best fermentation cycle
注：实验号1-9分别代表发酵培养至12、14、16、18、20、22、24、26、28小时的菌液
13
产淀粉酶的枯草芽孢杆菌培养基的优化
2.2.3 单因素实验结果
碳源是培养基的最主要成分，是菌体的骨架，用于构成微生物的细胞物质和一些代谢产物[17] ，又是一种双功能的营养物，可为微生物提供新陈代谢所需能源。
从图2-3可以看出，液体发酵培养基在分别以蔗糖、葡萄糖、乳糖、可溶性淀粉、玉米粉为唯一碳源时对发酵产物α-淀粉酶活力的影响。其中第4个实验号数值最大，即以蔗糖为碳源时，淀粉酶活力最大，可达到295.60u/L。其次是乳糖，淀粉酶活力为251.71u/L。
.
图2-3 不同碳源对α-淀粉酶活力的影响
Fig. 3 different carbon sources on α-amylase activity
注：实验号1-5分别代表玉米粉、乳糖、葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉
氮源主要用于构成菌丝体细胞物质和含氮的目的产物。有机氮源中除含有丰富的蛋白质﹑多肽﹑氨基酸外，往往还含有少量脂肪﹑糖类﹑维生素以及某些生长因子，因而微生物在含有有机氮源的培养基中表现为生长旺盛，菌体浓度增长迅速，代谢产物积累丰富等特点。
在以蔗糖为唯一碳源，其它条件不变的前提下，从图4可以看出液体发酵培养基在分别以牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、硝酸钾、豆粉为唯一碳源时对α-淀粉酶活力的影响。其中第1个实验号数值最大，即以蛋白胨为氮源时，淀粉酶活力最大，可达到258.5u/L。在以其它元素为氮源时，淀粉酶活力相对较低。
14