8.5是否染菌问题如果要区分是否染菌，可以取一些到显微镜下观察，或者闻气味（酸甜的是酵母），观颜色（乳白色的是酵母）。有可能会在没有达到4天的时间培养基就干了，所以可以适当补充一些，以及在摇床里放置盛有无菌水的深口瓶，来保持摇床里湿度。
8.6诱导无甲醇添加问题诱导物甲醇注意要在超净台中打开，可以分装到灭过菌的瓶子中（当然甲醇是不能灭菌的，而且也要注意在用酒精灯过甲醇瓶口的时候要小心，如果真的引起爆炸那可就损失大了）。另外如果觉得每天添加甲醇麻烦，也有人用一次性注射器透过纱布添加甲醇，这个方法可能会造成染菌，慎选。
8.7诱导后通氧问题酵母在无氧和有氧的情况下都可以存活，但是在甲醇诱导的情况下毕赤酵母用的是醇氧化酶，自然氧气量对于这基因的表达影响重大，但是由于害怕感染大肠杆菌，纱布裹的也不能太少，最好专辟出一个摇床进行三十度酵母表达，这样可以考虑将纱布减少到3—5层，同时需要注意的是摇瓶内菌液体积不要超过10-30%。
8.8取样SDS-PAGE分析问题样品不一定要1煮过冻存，但应避免反复冻融，最好分装保存。另外为了防止蛋白在分泌出来的过程就降解了（特别是小分子蛋白），也可以通过调节培养基pH值抑制蛋白水解酶的活性（这一方面说明书讲解得详细），还可以加入酪蛋白氨基酸等保护物质，竞争性抑制蛋白水解酶的活性来防止表达产物降解。
8.9样品浓缩问题分泌型培养基，由于培养基中的蛋白浓度低，PAGE胶一般是检测不出来的（除非你的表达蛋白量非常大）。浓缩方法有TCA法，硫酸氨盐析，PEG沉淀，透析，超滤等等。另外跑胶的时候同时对照酵母胞内蛋白，以防没有分泌出来。如果小到20kD以下，可以考虑用tricine胶
8.10样品纯化问题如果选用的载体是带有信号肽的，分泌表达好纯化，但实
际上毕赤酵母本身还是有本底表达的，而且有时候会造成假阳性，最后表达过程需要用Western blot或者Elasa，通常都是用WB。如果本身蛋白没有合适抗体（如果是利用从大肠表达出来的蛋白做出的抗体也有可能与用真核系统表达出来的蛋白无法发生免疫作用），可以选用anti-myc或者anti-his的，前提当然是你的蛋白没有提前终止。
8.11分泌表达问题蛋白明明加上了信号肽，但是就是无法分泌出来，其他载体构建没问题。这可能是蛋白结构在通过细胞膜的时候受到了阻碍，可能需要重新转化，更换线性化位点或者更换菌株；
如果蛋白表达第一天较高，但是之后越来越少，这很有可能是蛋白降解了或者产生了竞争表达；毕赤酵母无法重复的问题比较严重，许多情况下在第一次获得了高量表达之后就再怎么也重复不了这个结果。
表达出来的蛋白分子量偏大则是个正常现象，除了糖基化以外还有其它原因，比如二聚体，这些需要进行WB或进一步实验验证。
9. 发酵和产物纯化问题
9.1 his-tag 纯化用的组氨酸尾巴可能会对产物造成影响