15.大肠杆菌生活在培养基中：1 只有葡萄糖，2 同时有葡萄糖和乳糖，3 只有乳糖，叙述在这三种情况下lac操纵子的正负调控因子对转录的调控？
3个lac基因lacZ，lacY，lacA在大肠杆菌基因组中相邻排列合称lac操纵子。LacZ编码半乳糖苷酶，该酶可将乳糖切割成半乳糖和葡萄糖，后两种均可作为细菌的能源lacY编码乳糖转移酶将乳糖运至细胞，lacA的产物可消除被转入的硫代半乳糖苷对细胞造成的毒性。这些基因只有在乳糖存在，同时葡萄糖缺乏事才会被高水平地表达。两种调控蛋白参与调控：活化子CAP和Lac抑制子。CAP只在没有葡萄糖的时候才结合DNA以激活lac基因，而Lac抑制子只在乳糖缺乏时才结合DNA从而抑制转录。所以当只有葡萄糖存在时，抑制子将结合DNA的启动子或附近的特异位点，抑制lac基因的表达。当只有乳糖存在时，抑制子没有活性，而CAP将结合DNA激活基因的表达。同时有葡萄糖和乳糖时，抑制子和活化子都无活性，基因此时本底水平转录。
16.Trp操纵子在不同Trp浓度下如何受抑制子和衰减子的双重调控？
Trp浓度低时，Trp抑制子不结合其辅抑制子并退出其操纵子，允许trp mRNA从附近启动子起始合成；核糖体停在色氨酸密码子附近，使得序列2同序列3配对，阻止了3，4终止发卡的形成。
Trp浓度高时，辅助因子结合到Trp抑制子上，诱导该蛋白的构象变化，使其可以结合trp操纵子并阻止转录。已经起始转录的RNA聚合酶在特异位点暂停，接着在到达trpE之前终止，称为衰减作用；序列3可以与序列4配对，形成转录终止发卡。
无蛋白质合成时，如果无核糖体起始先导肽的AUG翻译，序列1，2形成发夹，阻止了2，3发夹的形成，允许序列3，4形成发夹，酶不表达。
抑制和衰减二种方式对表达的控制对色氨酸水平精细调节，使细胞对逐渐增强的Try饥饿有二种状态的反应，最初的反应是解除抑制的结合，Try饥饿更严重时，则是放松衰减作用。阻抑和衰减两种方式对表达的控制使得基因能精确地调节细胞内的色氨酸水平。
17.叙述原真核中基因调控的异同点。
相似点：1 核心调控原理相同，都是利用信号，激活蛋白和阻遏蛋白的招募，异构和协同结合发挥作用。
2 调控过程中的基因表达步骤相似，主要发生在转录的起始阶段。
不同点：1 对于真核生物，mRNA前体的剪接是调控的重要阶段，而原核生物的调控过程无此阶段。
2 真核生物的翻译机器比原核生物的更为复杂和精巧。
3 真核生物中，核小体和其修饰体影响基因的可接近性，而原核生物没有这种机制。 4 真核基因有更多的结合位点和更多的蛋白质进行调控。
18.真核调控蛋白的结合域及转录激发域有什么结构特征？
结合域：
1 同型结合域：是一种典型的螺旋-转折-螺旋DNA结合域，不同蛋白质中此结构域的结构非常相似，不仅识别螺旋相似，周边其他蛋白质结构也是一样的。
2 含锌结合域：包含锌原子的结合域，有各种不同的形式，包括典型的锌指蛋白和相关的锌簇域。锌原子同半胱氨酸残基和组氨酸残基作用，起到保持结合域完整的作用。DNA同样被嵌入大沟中的螺旋识别。有些蛋白质拥有多个锌指域，每个域都以螺旋嵌入大沟，并同其他锌指域延伸以增加结合的亲和力。还有一类域中，锌同4个半胱氨酸残基作用，稳定地形成一个识别域。 3 亮氨拉链结构域：在单一的结构单元内连接2聚结构和与DNA结合的表面。两个长的螺旋形成一个嵌型结构，将DNA夹于其中。二聚化是由同样两个螺旋内另一个区域介导，他们形成一个短的盘绕状结构结合到一起。
4 螺旋-环-螺旋模体：每个单体中延伸的螺旋区域嵌入DNA的大沟中，2聚体的表面由两个螺旋区域构成。 激活域：
1 一直没有一个明确的结构，这种结构是受DNA结合诱导的，具有黏性表面，能同其他几种蛋白质相互作
用。
2 由许多重复的，有弱的活化能力的小单元组成，每个单元都是一端短的DNA序列。这样的小单元越多，酸性越强，激活域的活化能力就越强。这同激活域缺乏一个整体上的结构，只是简单的作为一种无差别的黏性表面在起作用这个概念是一致的。
19．siRNA研究和治疗上各有什么作用？
在研究上：1被应用于反向遗传学中鉴定一个细胞的细胞学和生物学功能，2可以同基因组学结合，进行基因组范围的筛选，发现新的功能基因。
在治疗上：1被应用于抵抗病毒的感染，通过摧毁病毒特异性mRNA的方式，如HIV，HBV;2被应用于抗癌，通过降低与致癌有关基因的表达作用
20．试论述生物的复杂性是miRNA调控的结果？
miRNA广泛存在于动植物细胞中，形成了RNA-protein复合体，控制动植物的发育过程，miRNA种类繁多，可以认为不同的miRNA控制了不同生物各个阶段的发育过程，据最新的研究所知，miRNA可以控制植物的表型特征；miRNA调控造血干细胞的分化；部分病毒也编码miRNA.
21．翻译的起始、延长和终止（具体过程和翻译因子的作用）？
1）起始：3个重要事件：第一，核糖体必须被募集到mRNA上；第二，负载tRNA必须置于核糖体的P位点；第三，核糖体必须精确地定位在起始密码子上，这一步最关键，它确定了mRNA的阅读框 原核细胞因子：IF1防止tRNA结合到小亚基未来A位置上
IF2是GTP酶，它与起始过程的3个主要成分相互作用。通过这种作用，催化fMet-tRNAi和小亚基的结合，阻止其他负载tRNA与小亚基结合
IF3结合于小亚基并阻止其与大亚基结合，或阻止其与负载tRNA结合。，它与小亚基的结合对翻译的每一轮新的循环是十分重要的。
真核细胞因子：起始tRNA和小亚基的结合总是发生在和mRNA结合之前。eIF3和eIF1A因子的作用解离为游离的大小亚基。两个GTP-结合蛋白——eIF2和eIF5B介导了（小亚基）和负载起始tRNA的结合。并通过poly-A尾与mRNA的3’端紧密结合。，这是通过eIF4F和包绕在poly-A尾的poly-A尾结合蛋白之间的相互作用实现的。
2）延长：3个关键事件：第一，在A位点上的密码子的指导下，正确的氨基酸tRNA置于A位点上；第二，A位点的氨基酰tRNA与P位点的肽酰tRNA上的肽链形成肽键，这一肽转移酶反应导致多肽链从P位点的tRNA上转移到A位点的负载tRNA的氨基酸残基上；第三，形成的A位点的肽酰tRNA和相应的密码子必须易位至P位点，以使核糖体为下一轮循环的密码子识别和肽键形成做准备。
延长因子：EF-Tu结合并水解GTP，并且鸟嘌呤核苷酸的类型决定了EF-Tu的功能。只有当EF-Tu与GTP结合后，EF-Tu残能结合氨基酰tRNA。
EF-G的延伸因子的作用是促进tRNA和mRNA的易位，EF-G只有在和GTP结合的情况下才能结合核糖体。而EF-G通过取代结合在A位点的tRNAl来驱动易位。
3）终止：氨基酸tRNA的结合、肽键的形成和易位的循环在3个终止密码子的其中之一进入A位点时就终止了。
因子：I类释放因子识别终止密码子，并催化多肽链从P位点的tRNA中水解释放出来。原核细胞有2种释放因子RF1、RF2。RF1识别终止密码子UAG，RF2识别终止密码子UGA，两者均可识别UAA。真核细胞只有一种能识别3个终止密码子的释放因子eRF1。 II类释放因子RF3、eRF3,是一种结合蛋白，且与GDP的亲和力大于GTP的亲和力。主要是以与GDP结合的形式存在。
22．mRNA和蛋白质稳定性依赖于翻译？（生物学问题是什么，怎么解决的）
1） SsrA RNA援救翻译着断裂mRNA的核糖体
SsrA RNA是一个由457个核苷酸组成的tmRNA，当一个核糖体停止于mRNA的3’端时，
SsrA-EF-Tu-GTP结合于核糖体的A位点并参与肽转移酶反应，氨酰SsrA RNA的易位导致缺陷的mRNA从核糖体中释放出来。
2） 真核细胞降解不完整的或终止密码子提前的mRNA
无义密码子介导的mRNA衰减：哺乳动物细胞中，对含有提前的终止密码子的mRNA的识别依赖于聚集在mRNA的可读框内蛋白复合体。如果mRNA存在一个提前的终止密码子，那么核糖体就在这些故合体被置换之前，从mRNA上脱离出来。复合体作用于提前终止的核糖体，激活一种去除mRNA的5’端帽结构的酶。帽结构的去除就导致rnRNA很快的被5’---3’核酸外切酶所降解。
无终止密码子介导的mRNA衰减：当缺失终止密码子的mRNA翻译时，核糖体就会翻译多聚A尾。这就导致了蛋白质的末端添加了多个赖氨酸，并且核糖体停止在mRNAde 3’端。停止的核糖体与Ski7蛋白结合，刺激核糖体解离并吸引3’—5’核酸外切酶降解“无终止”mRNA。
综上，mRNA的降解都需要mRNA的翻译，在没有翻译的情况下，受损的mRNA并不被很快的降解，而且具有正常的稳定性。真核细胞要依赖翻译的机制来校正它们的mRNA
补充习题：
1.什么是clone？克隆的步骤是什么？(貌似应该是DNA clone)
答：构建重组DNA分子并在细胞中保存和扩增这些分子，叫作DNA克隆。
克隆（clone）是指通过无性生殖而产生的遗传上均一的生物群，即具有完全相同的遗传组成的一群细胞或者生物的个体。
克隆的步骤：1 通过体外合成，即聚合酶链反应（PCR）。先合成两条单链寡聚核苷酸。一条寡聚核苷酸与要扩增的DNA的一条链的5端互补，另一条则与另一条链的5端互补。然后使要扩增的DNA变性，寡聚合苷酸和它们的靶序列退火。此时在反应中加入DNA聚合酶和脱氧核苷酸底物，此反应能在DNA两条链的目的区域处产生双链DNA。经过第一个循环产生了DNA起始片段的两个双链拷贝。再进行另一轮变性，用相同的引物进行DNA合成，则可呈几何级数将DNA进行扩增。
2 通过细胞分裂的方式进行。首先用DNA限制酶将DNA切割成片段得到插入DNA，接着将此片段插入到满足一定条件的载体中，即载体要满足1能独立于宿主染色体进行自主复制；2含有选择标记；3含有一个或多个限制酶的单个酶切位点。最后使载体DNA通过转化导入宿主生物体中进行扩增。
2.克隆载体和表达载体的特征是什么？
答：载体DNA的特征有：（1）载体含有一个复制起点，他们能独立于宿主染色体进行自主复制。（2）载体含有筛选标记，这使我们容易鉴别阳性重组分子。（3）载体含有一个或多个限制酶的单个酶切位点，从而可以使DNA片段插入于载体的特定位点。
表达载体的特征：它能使特定DNA的分离、纯化成为可能，还能驱动插入DNA内基因的表达。
3.基因组文库和cDNA文库各是什么？
答：基因组文库是指一群重组DNA分子，它们由同一种载体和不同的DNA插入片断组成。
cDNA文库是指用反转录酶使mRNA转换变成双链DNA拷贝的这些集合。
4.Southern Blot、Northern Blot、Western Blot指的是什么？
答：Southern Blot是指Southern印迹杂交技术。用于鉴定含有目的基因的限制性片端的长度。具体方法：DNA分子经限制性内切核酸酶消化产生的DNA片段在琼脂糖凝胶中电泳。染色后，可以看到一系列条带。将电泳带转移至虑膜，用只和DNA分子的一个特定序列同源的DNA片段作探针进行杂交，能看见单一条带，其位置对应于含有此序列的片段在凝胶上的位置。
Northern Blot是指用于鉴定mRNA的印迹杂交技术。具体方法与Southern Blot相同。
Western Blot是指免疫着色。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。（来自百度知道）
5.凝胶过滤层析、离子交换层析和亲和层析的原理各是什么？
答：凝胶过滤层析：这种技术根据蛋白质的大小和形状来分离它们。这种层析中所用的珠子没有带电荷基团，但是含有不同大小的孔径。小蛋白质能进入所有孔径，流经柱子的距离长，洗脱时间也长；大蛋白质流经柱子的距离短，洗脱速度快。
离子交换层析：这种技术根据蛋白质的表面离子电荷的不同，采用经带正电荷或负电荷化学基团修饰的珠子对蛋白质进行分离。在低盐缓冲液中，和珠子相互作用较弱的蛋白质能被洗脱。如果蛋白质和珠子相互作用较强，洗脱时就需要更高的盐离子浓度。逐渐增加洗脱缓冲液中的盐离子浓度，可以将带有相似电荷的蛋白质分离成不同组分。
亲和层析：人们通常根据某一蛋白质的特性来更加快速地纯化这种蛋白质。例如，如果你知道某一蛋白质通过和ATP结合而起作用，我们就可以使用含有ATP结合珠子的层析柱。由于只有与ATP结合的蛋白质能与层析柱结合，大多数蛋白质由于不能结合ATP而直接流出柱子。这种纯化方法就叫做亲和层析。层析柱上也可以结合其他试剂来快速纯化各种蛋白质。
6.什么是融合蛋白？构建融合蛋白的用处是什么？（没有找到合适的答案，此概念只在P658提到）
答：利用重组技术来改变某一特定基因的表达，从而编码出的各个部分来自于不同蛋白质的杂合蛋白称融合蛋白。 用处：
7.如果给你一个肽段，你将用什么方法得到该肽段的编码基因？
答：要想得到某一肽段的编码基因，则首先要知道该肽段的氨基酸序列。测定氨基酸序列有两种方法：Edman降解法与随机质谱法。Edman降解是化学反应，通过PITC对肽链N端氨基酸的游离a-氨基基团的特异性修饰，经酸处理及控制反应条件后可使多肽链的N端挨个释放氨基酸残基。通过分析高效液相色谱（HPLC）的洗脱峰可鉴定末端氨基酸衍生物的性质，而且Edman降解可重复很多个循环，从而揭示蛋白质N端区段的序列。如果N端被化学修饰，则通常先用蛋白水解酶消化，暴露出蛋白质内部序列来进行测序。
随机质谱法能利用物质在真空中的行进与荷质比的关系来精确测定微量样品的质量。测序前，先用胰蛋白酶将目的肽段消化成许多小段，质谱分析时，肽段混合物中各小段由于荷质比不同，能相互区分。将如此分离到的单个肽段打碎成其组成肽段进行测序。这些序列数据能清楚地反应原始肽段的序列。
然后，通过我们已经得到所研究生物体的全基因组序列及目的肽段序列，生物信息学方法就能将蛋白质和基因组中的特定蛋白质编码序列对应起来，从而得到该肽段的编码基因。
8．什么是密码子？其组成规律是什么？
mRNA中相邻的三个核苷酸编码一个氨基酸，这个三联体核苷酸称为一个密码子。
组成规律：遗传编码的进化趋向于将突变的有害效应减少到最小。例如，密码子第一个位置上核苷酸的突变将使编码的氨基酸即使不完全相同，也比较相似。如果密码子第二个位置为嘌呤，则其编码的蛋白质往往是极性的，若是嘧啶，则通常是疏水的。最后，密码子第三个位置上发生突变也极少产生出不同的氨基酸。另外一个规律是，当密码子1，2位均为G或C时，编码的氨基酸与第三个位点无关，但当1，2位均为A或U时，编码的氨基酸与第三个位点有关。
9．支配遗传密码的三条规律是什么？
1． 密码子从5—>3方向阅读。
2． 密码子不重叠，信息之间无缝隙。
3． 信息在固定的可读框上翻译，这些可读框是由启始密码子设定的。
10.比较原核，真核生物翻译起始点和终止点的异同点。
起始点 相同点：他们都使用了起始密码子和专门的起始tRNA,都在大亚基加入以前利用起始因子形成结合mRNA的小亚基复合体。
不同点：真核细胞中，小亚基在被吸引到mRNA的5’端帽子结构之前，已经与tRNA结合，原
核生物中，小亚基在与mRNA结合之后，通过特定tRNA与起始密码子碱基配对机制，与tRNA结合；真核生物比原核生物需要更多的辅助蛋白来驱动起始程序，大于30种多肽参与了真核生物翻译的起始过程；它们起始tRNA负载的氨基酸不同，真核为Met.，原核为N-fMet(一种连接一个甲酸基的Met); 真核细胞43S前复合体对mRNA的识别是从对5’帽结构的识别开始的，而原核生物是在mRNA起始位点上组装70S起始复合体的。
终止点 相同点:翻译终止于核糖体遇见一个终止密码子，I类释放因子识别终止密码子，这些因子激活多肽链从肽酰tRNA中释放的水解反应，导致肽链释放出来。最后一个II类释放因子,一个核糖体循环因子和一个起始因子通过引起mRNA和脱氧核酸的tRNA的是释放以及核糖体的解离终止了翻译。原核与真核都只有一种II类释放因子。
不同点：原核细胞有两种I类释放因子：RF1和RF2, RF1识别终止密码子UAG, RF2识别终止
密码子UGA,两者都可以识别终止密码子UAA;真核细胞只有一种识别三个终止密码子的I类释放因子：eRF1.
11.原核，真核生物是如何找到翻译起始位点的？
原核细胞中，起始需要mRNA的核糖体结合位点与小亚基的16S RNA的作用来将核糖体吸引到mRNA上。这一作用由三个辅助蛋白（称为起始因子IF1,IF2,IF3）协助，使两个亚基保持分离。并由一个特殊的起始tRNA携带至起始密码子。起始tRNA的反密码子和起始密码子的配对导致大亚基的结合，起始因子的释放以及起始tRNA进入P位点（tRNA与小亚基结合）。这就是原核细胞的70S起始复合体，它为接受一个负载tRNA进入A位点并进行第一个肽键的形成做好了准备。
真核细胞中，mRNA通过5’帽的识别和许多辅助因子的作用来吸引小亚基。然后小亚基以5’—3’方向沿着mRNA巡视，直到遇见AUG-起始密码子。与原核细胞一样，只有在起始密码子AUG被识别后，大亚基才能结合与mRNA。除了与mRNA5’端结合，起始因子还通过ploy-A尾与mRNA3’端紧密结合，使真核mRNA保持环状，于是一旦核糖体完成了通过poly-A尾而环化的mRNA的翻译，新释放的核糖体被理想的放置于同一mRNA的起始翻译位点上。
12．胺酰tRNA核糖体对翻译的忠实性有什么好处？
胺酰tRNA合成酶承担如此多的责任以保证正确的氨基酸和正确的tRNA连接的原因在于，tRNA负载氨基酸离开此酶后，就不再有其他的鉴别过程。
13．tmRNA, SsrA RNA通过什么样的机制挽救滞留因断裂而缺乏终止密码子的原核mRNA上的核糖体？
在原核细胞，停止运转的核糖体是由一种嵌合的RNA分子解救的，这种RNA分子部分是tRNA，部分是mRNA，称为tmRNA。
SsrRNA是一个由457个核苷酸组成的tmRNA，它可以负载Ala并结合EF-Tu-GTP。当一个核糖体停止于mRNA的3’端时SsrAAla--EF-Tu-GTP结合于核糖体的A位点并参与肽转移酶反应，肽酰SsrA RNA的易位导致缺陷的mRNA从核糖体上释放出来
14．无义密码子通过什么机制介导真核mRNA的衰减？
当一个mRNA分子含有提前的终止密码子时，这一mRNA很快的被降解，这一过程称为无义密码子介导的mRNA衰减。对于含有提前的终止密码的mRNA的识别依赖于聚集在mRNA的可读框内的蛋白复合体。复合体作用于提前终止的核糖体，这样就激活一种去除mRNA的5’端帽结构的酶。由于mRNA的5’端帽结构保护防止降解的，因而帽结构的去除就导致mRAN很快被5’- 3’核酸外切酶所降解。
版权所有：武汉大学生命科学双学位班
鸣谢：武汉理工大学材料学院：袁涵，宋亮，王之明，王晓天，游永宁