葡萄糖氧化酶及其应用
【摘要】:葡萄糖氧化酶是一种需氧脱氢酶,对人体无毒、副作用，广泛应用于食品、医药、饲料等行业中，起到了去除葡萄糖、脱氧、杀菌等作用。该文从葡萄糖氧化酶的性质、生产和应用等方面对其进行了简单介绍。
【关键词】：葡萄糖氧化酶 性质 生产 应用
The glucose oxidase and its application
Abstract: Glucose oxidase (GOD) is an aerobic
dehydrogenase. It has no side effects and non-toxicity on human. GOX，which has played an important role on removing glucose，de-oxidization and sterilization，is widely applicated in food, medicine, feed stuff and other fields. This paper reviews the property, production and application of Glucose oxidase.
Key Words: Glucose oxidase property production application
葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase EC 1.1.3.4.）全称为β-D-吡喃型葡萄糖需氧脱氢酶，简称GOD，它能在有氧的条件下专一性将β-D-葡萄糖氧化为葡萄糖酸和过氧化氢。早在1904年，人们就发现了葡萄糖氧化酶，但当时对其商业价值认识的不足，并未引起人们的重视。直到1928年，Muller首先从黑曲霉的无细胞提取液中发现葡萄糖氧化酶，并进一步通过试
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验确定了酶的作用机理，并命名为葡萄糖氧化酶，之后把他归入脱氢酶类。葡萄糖氧化酶广泛的存在于动物、植物和微生物体内，微生物繁殖快，来源广的特点事其成为葡萄糖氧化酶的主要来源，主要生产菌株为黑曲霉和青霉。其广泛应用于食品、饲料、医药等行业中，起到了去除葡萄糖、脱氧、杀菌等作用。
产量低、酶活低、检测方法复杂是GOD产业化的限制性因素。国外由于对葡萄糖氧化酶的研究较早，在菌种筛选、产酶条件的优化、酶的分离纯化、酶学特性以及葡萄糖氧化酶基因的克隆与表达等方面研究都已较为深入。相比国外，我国对葡萄糖氧化酶的研究工作起步较晚，从20世纪末期对其展开了较为系统的研究。我国受技术水平以及仪器设备的限制，目前生产的工业酶制剂不仅生产成本高，而且纯度以及稳定性方面都达不到要求，工业酶制剂市场基本被国外企业所垄断，而如何降低葡萄糖氧化酶的生产成本和提高其应用适应性是
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急待解决的问题。
1. 葡萄糖氧化酶的性质
1.1 物理性质
粉状的葡萄糖氧化酶呈灰黄色，液状的葡萄糖氧化酶为淡褐色，精制液体状酶为淡黄色。易溶于水，不溶于不溶于乙醚、氯仿、丁醇、吡啶、甘油、乙二醇等有机溶剂，50%丙酮和66%甲醇能沉淀该酶，溶液在摇动时泡沫呈棕绿色，不能透过硝化纤维膜。固体葡萄糖氧化
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酶在0℃条件下至少能保存2年，在-15℃下可保存8年。
1.2 化学性质
葡萄糖氧化酶相对分子质量一般在1.5×105左右，每分子酶含2分子FAD。pH作用范围3.5~6.5，最适pH为5.0左右，在没有保护剂存在的条件下pH >8.0或pH <3.0时会迅速失活。葡萄糖氧化酶的作用温度范围一般为30～60℃，最适作用温度为50～55℃。葡萄糖氧化酶能高度特异性的结合β-D-吡喃葡萄糖，葡萄糖分子C1上的羟基对酶的催化作用是必要的条件，而且羟基位于β-位时酶的活性比位于α-位时酶的活性高大约160倍。底物的分子结构在C1、C2、C3、C4、C5、C6位上的改变使葡萄糖氧化酶的活性大幅度下降，但在不同的程度上还表现出一定的活性，见表1。葡萄糖氧化酶对于L-葡萄糖和2-O-甲基-D-葡萄糖是完全没有活性的[3]。
表1 葡萄糖氧化酶的底物特异性 葡萄糖改性的位置
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化合物 β-D-葡萄糖 α-D-葡萄糖
同β-D-葡萄糖的差别
C1上OH的构型
相对速率 100 0.64
续表 1 葡萄糖氧化酶的底物特异性 葡萄糖改性的位置
2
化合物 2-脱氧-D-葡萄糖
同β-D-葡萄糖的差别 C2上OH被H取代
相对速率 3.3
2
2 2 3 4 4 5 5 6 6
D-甘露糖
2-O-甲基-D-葡萄糖 3-脱氧-D-葡萄糖 D-半乳糖 4-脱氧-D-葡萄糖 5-脱氧-D-葡萄糖 L-葡萄糖 6-脱氧-D-葡萄糖 木糖
C2上OH的构型
C2上OH的H被甲基取代 C3上OH被H取代 C4上OH的构型 C4上OH被H取代 C5上OH被H取代 C5上CH2OH的构型 C6上OH被H取代 C6被H取代
0.98 0 1 0.5 2 0.05 0 0 0.98
1.2.1 葡萄糖氧化酶的作用机理
葡萄糖氧化酶能利用分子氧或原子氧进行葡萄糖的氧化,消耗溶解氧,降低氧的氧化作用,从而保护食品中易氧化成分不被氧化。葡萄糖氧化酶的催化反应按反应条件有3种形式: （1）没有过氧化氢酶存在时,每氧化1分子葡萄糖消耗1氧: C6H12O6+O2→C6H12O7+H2O2
β-D-葡萄糖+O2→δ-D-葡萄糖内酯+H2O2
(2) 葡萄糖氧化酶通常与过氧化氢酶组成一个氧化还原酶系统，当反应体系中葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶同时存在时，首先葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化生成D-葡萄糖酸内酯和过氧化氢，然后过氧化氢酶催化过氧化氢生成水和氧气，最后水与D-葡萄糖酸内酯结合生成葡萄糖酸 :
C6H12O6+1/2O2→C6H12O7+H2O2
(3) 当反应体系中葡萄糖氧化酶过氧化氢酶和乙醇同时存在时,首先葡萄糖氧化酶催化 β-D-葡萄糖生成D-葡萄糖酸内酯和过氧化氢,然后过氧化氢酶催化过氧化氢和乙醇生成水和
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乙醛,最后水与D-葡萄糖酸内酯结合生成葡萄糖酸。
C6H12O6+C2H5OH+O2→C6H12O7+CH3CHO+H2O2
研究表明，葡萄糖氧化酶催化反应的速率同时取决于O2和葡萄糖的浓度，反应遵循乒乓机理。
1.2.2 温度对酶活性的影响
葡萄糖氧化酶反应体系中含有气体反应物氧，所以反应温度的变化导致氧在反应体系中浓度的改变，因为温度升高时，反应体系中氧气的溶解度下降，这就抵消了温度升高对酶反应速率的影响。从表2中可以看出：其一是葡萄糖氧化酶催化的反应具有较低的Q10；其二是葡萄糖氧化酶在较宽的范围内（30～60℃)具有活性，且差异不大。表中所列出的葡萄糖
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氧化酶活性是采用量压法测定30min内反应体系吸收氧气的数量而得到的。
表 2 温度对葡萄糖氧化酶活性的影响
温度/℃ O2吸收/μL 相对活性 0
Q10 3
温度/℃ O2吸收/μL 相对活性 40 330 1.1 Q10 1.1 154 0.51
10 20 30 178 230 300 0.59 0.77 1.0 1.15 1.3 1.3 50 60 314 306 1.05 1.02 0.95 0.97 1.2.3 pH对酶活性的影响
葡萄糖氧化酶的活性在pH为4.5～7.0基本上相同，变化不大，pH高于7.0或低于4.5
活性急剧下降。但同样的pH条件下葡萄糖底物的存在对酶活性有保护作用，如pH在8.1时，当无葡萄糖底物的存在时，酶活性在10min内损失90%，当葡萄糖底物的存在时，酶活性在40min内仅损失20%,。低pH条件下，霉菌葡萄糖氧化酶仍然具有一定的催化活性，只是反映的速率较低，但仍然可以完成特殊的催化反应。
1.2.4 酶的抑制剂
铜离子和其他巯基（—SH）螯合剂能抑制霉菌产生葡萄糖氧化酶的活性，阿拉伯糖是酶的竞争性抑制剂；氰化氢和一氧化碳对酶没有抑制作用。
2、葡萄糖氧化酶的生产
葡萄糖氧化酶是酶技术研究与应用领域中一种非常重要的酶，由于葡萄糖氧化酶与生命的重要物质葡萄糖和氧的密切关系，导致了他在科研、医药和工业生产上的广泛应用。葡萄糖氧化酶广泛分布于动植物和微生物体内,但动植物组织中葡萄糖氧化酶含量有限，而微生物由于具有来源广泛、生长周期短等优点被广泛用作生产葡萄糖氧化酶的来源。但通常天然菌株产葡萄糖氧化酶水平不高，难以直接用来生产葡萄糖氧化酶。一方面我们可以通过菌株诱变、优化菌株的发酵条件等传统方法，获得葡萄糖氧化酶高产菌株;另一方面，通过基因
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重组等方法获得葡萄糖氧化酶高产菌株，采用重组工程菌获得葡萄糖氧化酶。
2.1 工业化生产葡萄糖氧化酶的菌株
目前工业化生产葡萄糖氧化酶是利用微生物发酵法生产,可以生产葡萄糖氧化酶的微生物主要是细菌和霉菌。细菌主要有弱氧化醋酸菌等;生产上一般采用的霉菌是黑曲霉和青霉属菌株,除了黑曲霉和青霉外，拟青霉属(Paecilomyces )胶霉属( Glioctadium)及帚霉属( Scopulariopsis)等也具有产葡萄糖氧化酶的能力工业化生产葡萄糖氧化酶的主要菌种见表3。
表3 工业化生产葡萄糖氧化酶的主要菌种 菌属 青霉 具体菌种 点青霉(Penicillium notatum )、生机青霉(Penicillium uital )、产黄青霉(Penicillium chrysogenum )、灰绿青霉( Penicillium glaucum)、尼崎青霉(Penicillium 4
曲霉 其他菌属 amagasakiense )、紫色青霉(Penicillium notatum ) 米曲霉( Aspergillus oryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger )、土曲霉（Aspergillus terreus） 镰刀霉属( Fusarium)、柠檬酸霉属(Citromyces ) 2.2 利用菌株诱变获得葡萄糖氧化酶
对葡萄糖氧化酶生产菌株的诱变通常采用紫外诱变和化学诱变剂诱变等方法
。紫外
线照射通过改变菌体DNA从而引起菌体的突变。李筱瑜等人[7]。将黑曲霉菌株P-采用紫外线进行诱变，得到突变菌株U-69产酶酶活是出发菌株P-的2.5倍.
化学诱变是用化学诱变剂处理菌种，以诱发遗传物质的突变。化学诱变相比于紫外诱变更具定向性，化学诱变剂不同，作用的菌株、细胞及基因不同，诱变的效果也会存在差异。常用的化学诱变剂有甲基磺酸乙酯(EMS )和硫酸二乙酯(DES )等[1]。
选择单独一种诱变方法，也可以几种方法复合使用，筛选出其中的正突变菌株，提高原始菌株产酶能力。
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2.3 利用基因重组技术获得葡萄糖氧化酶
工业化生产中常用黑曲霉或青霉发酵来获得葡萄糖氧化酶，但黑曲霉和青霉菌发酵过程中常会伴随产生过氧化氢酶 淀粉酶等其他杂蛋白，给后期的分离纯化工作带来困难，因此用基因工程方法构建更优良的葡萄糖氧化酶生产菌株一直受到各国科学家的注视。将葡萄糖氧化酶的基因进行克隆，连接相应的表达载体后转化基因工程菌株，通过诱导表达葡萄糖氧化酶基因来获取大量的葡萄糖氧化酶蛋白。由于基因工程菌株分泌到基质中的其本身内源蛋白量很少，基质中主要是基因工程菌株分泌到胞外的外源目的蛋白，因此能简化后期的蛋白纯化操作。
目前国外主要用基因克隆、表达来提高菌株的产酶活力，在这一领域研究已经比较深入。Whittington H成功地将青霉菌的GOD基因导入到酿酒酵母中，获得了具有生物活性的；
［］
Szynol实现了葡萄糖氧化酶基因在大肠杆菌中的表达8；Silvia Crognale将一株青霉的葡萄糖氧化酶基因成功导入到毕赤酵母中，发酵培养酶活达到50U/ml ;国内在这一方面的研究也取得了一定的进展。母敬郁等[9]采用瑞氏木霉表达了黑曲霉来源的葡萄糖氧化酶基因，经过对重组后的瑞氏木霉进行诱变筛选，突变株的葡萄糖氧化酶发酵液酶活达到25U/ml 。
目前已有多种外源基因表达系统被开发出来，如大肠杆菌表达系统、酵母表达系统等大肠杆菌表达系统虽然发展较为成熟，操作简单、周期短、产量高，但其表达产物无翻译后的修饰与加工过程，不能对蛋白质进行翻译，酵母繁殖速度快、易于培养、基因工程操作简便，
［］
并能够对目的蛋白进行翻译后加工与修饰，越来越广泛地用作外源基因表达的宿主菌株1。 虽然目前利用基因工程的手段实现了葡萄糖氧化酶的异源表达，但是由于表达量不高导致的生产成本高的问题仍然没有得到有效的解决，阻碍了葡萄糖氧化酶的大规模工业化生产及应用。因此如何采用基因工程技术实现葡萄糖氧化酶基因的高效表达，使葡萄糖氧化酶的产量得到大幅度的提高成为了亟待解决的关键问题。
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