microRNA（miRNA）引物设计及过程原理说明
microRNAs的平均长度23nt左右，所以miRNA引物设计与常规引物设计存在很大差别，以下讲解一下整个miRNA引物设计的过程加上实验流程，以帮助大家对各方面的学习。
首先，引物设计之前先介绍miRNA反转录合成cDNA的过程。 我们拿经典颈环序列
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC作介绍。打开DNAstar软件的PrimerSelect；file打开下拉菜单；打开Enter New Primer…；粘贴颈环序列；点击OK。
颈环结构已经输入，下面查看颈环结构回形成的那些发夹结构。 选择颈环结构（鼠标点一下）；点击Report下拉菜单；选择Primer Hairpins。
第一个发夹结构是实验所需的结构(dG=-20.4kc/m)。 下面结合has-miR-122-5P合成cDNA的具体过程讲解has-miR-122-5P：UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUGU 将U转T，方便后面使用：TGGAGTGTGACAATGGTGTTTGT
miRNAs的颈环结构引物：是将miRNAs的3’端后6位碱基反向互补添加到经典颈环结构的3’端形成的结构。(自己根据后面图片想一下原因，加6个碱基为经验所授) has-miR-122-5P的后6位：GTTTGT
has-miR-122-5P的后6位的反向互补序列：ACAAAC 颈环引物序列：
5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAAAC -3’
查看形成的发夹结构（方法前面有讲）
看一下miRNA和颈环引物在一起会是怎么样子：
在含反转录酶及适当的条件下，miRNA和其颈环引物将会合成cDNA链：
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAAACACCATTGTCACACTCCA
查看cDNA结构：
我们知道了cDNA的合成过程和序列，同时学习了miRNA的反转录过程。
下面进入重头戏，教大家如何进行miRNA引物设计。首先如果你的前面实验是芯片的就在miRbase上再查看核对一遍，如果是测序实验的需要将miRNA的名字3p或5p及之前的部分复制到miRAN上查找完整序列。将得到的miRNA完整序列复制到一个excel表中，然后使用查找替换将U改为T（一定要记住改换，要不然primer5.0是不认U的）。
为了后面引物设计方便，需要以miRNA序列构建引物，所以需要将miRNA的cDNA的反向互补序列找出。使用primer5.0。 打开File下拉菜单；New；DNA Sequence。
由于正规设计过程中不会先把cDNA序列找出来，所以直接操作过程为先将miRNA序列（U改T）输入，再输入颈环结构序列的反向互补序列。
复制miRNA序列（U改T）；点击primer5.0序列框，使用组合键“Ctrl+V”粘贴序列；选择正向序列。
复制颈环结构序列；点击primer5.0序列框，使用组合键“Ctrl+V”粘贴序列；选择反向互补序列输入Reverse Complemented。
到这一歩cDNA的反向互补序列已经输入完毕，下一歩是在primer5.0上进行引物设计。
1. 在序列前面输入9个N（这个是个人习惯，也有人是6个或以上的A，也有人是不输入就直接设计引物的），因为miRNA序列太短，很多时候不能设计出符合实验需要的miRNA，所以在