湖北大学硕士学位论文
机制。lin-41编码一种RBCC(Ring Finger，B box，coiled coil)蛋白。Lin-41的分子功能目前还不清楚，这种蛋白质包含了几个结构域：一个RING finger、B框和卷曲螺旋，另外还有几个NHL的拷贝[ Ncl、HT2A和lin-41（被认为是含有这种氨基酸基序的第一种蛋白质）]，这种蛋白质的结构域在动物进化上是保守存在的，这很可能暗示在蠕虫内由lin-41调控的时序模式途径也适合于其他生物。这些具有明显时间表达特异性的小分子RNA，当时科学家将称为小分子时序RNA(small temporal RNA，stRNA)。时序基因lin-4和let-7则被认为是miRNA家族的典型代表。到目前为止，已报道有几千种miRNA 存在于动物、植物、真菌等多细胞真核生物中，进化上高度保守。在植物和动物中，miRNA 虽然都是通过与其靶基因的相互作用来调节基因表达，进而调控生物体的生长发育，但miRNA 执行这种调控作用的机理却不尽相同。
1.2.2 miRNA的发生及作用机制
1.2.2.1 miRNA的发生
虽然现在数以百计的miRNA已经从各个物种中被分离得到，但指导它们产生的基因组编码信号依然还没被鉴定。RNA聚合酶Ⅱ将最初的miRNA前体转录物（pri-miRNA）转化成天然的miRNA。事实上，现在所有的新近鉴定的miRNA还没有和它们调控的靶子配上对，没有哪个动物的miRNA能让我们看到它能和一个蛋白质编码基因精确地反义互补，因此使得通过扫描基因组来寻找靶基因变得更加复杂，而且，miRAN和靶基因形成不完全互补双链的结构模式还很难捉摸。mi RNA从茎环结构的前体中产生，前体转录物自身可以通过不完全的碱基配对折叠形成茎环结构，该结构在动物中的长度为70—80 nt，而在植物中的长度为80-250nt。在动植物中，pri-miRNA要比茎环结构长得多，可以达到几千kb。 茎环结构中的5’-或 3’-端的臂都可以形成成熟的miRNA。植物mi RNA的前体在细胞核中由Dicer -like protein 1 ( DCL1) 经过剪切加工最终形成成熟的 mi RNA并释放到细胞质中。动物miRNA广泛存在基因簇现象，即多个miRNA由同一个前体RNA加工而来，且来自同一基因簇的miRNA具有较强的同源性，不同基因簇的miRNA的同源性则较弱[12]基因组的基因之间及结构基因的内含子区域均存在大量编码miRNA 的基因，因此，来源于 pre-mRNA 内含子区域的miRNA 伴随pre-mRNA的剪接而形成；而植物miRNA多数由单一pre-RNA加工而来，只有极少数miRNA，如miR395 存在基因簇现象[13]。除了极少数特例(编码miR402 的基因被发现存在于 pre-mRNA 内含子区域[14]，编码miRNA的基因主要存在于编码蛋白的基因
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第一章 文献综述
之间的区域，且大多是远离 miRNA目标基因的独立的转录单元。
miRNA的发生主要的过程主要分为2个阶段：(1) 启动阶段，pri-miRNA首先在细胞核内被核糖核酸酶Ⅲ（RNaseⅢ）剪切，放出一个60-80nt的发卡结构中间体，即miRNA前体（ miRNA precursor，pre-mi RNA）并释放到细胞质中，这一过程需要依赖Ran GTP∕exportin-5的转运机制来完成的。（2）效应阶段，释放到细胞质中的pre-mi RNA由Dicer酶或者Dicer酶类似物剪切成约21nt长度的miRNA：miRNA﹡双链形式
[15]
.。随后miRNA 的双链解链形成成熟的单链miRNA[7]，成熟的单链miRNA和内切
核糖核蛋白以及其它蛋白质一起形成RNA介导的沉默复合体 RISC (RNA-induced silencing complex)。成熟的miRNA与RISC的核糖核蛋白结合形成miRNP 而发挥作用
[16]
。其中RISC的核酸部分起靶向性的作用，而蛋白质部分则起到降解信使RNA(m RNA)
的作用。植物中，细胞核内编码miRNA 的基因的转录与加工是偶联的，即miRNA的形成过程是在细胞核中完成的，不存在miRNA前体从细胞核到细胞质的运输过程。首先，细胞核中编码miRNA 的基因在RNA聚合酶Ⅱ的作用下转录形成长度约为几百个核苷酸的初级转录物pri-miRNA；然后在一种类似Dicer 酶-DCL1 的作用下形成miRNA 前体premiRNA[16]，该前体长度一般为64－303 nt，DCL1继续作用于pre-miRNA 而形成双链miRNA；最后，双链miRNA在miRNA甲基转移酶-HENI的作用下，使3' 端最后一个核苷酸发生甲基化修饰。 1.2.2.2 miRNA的作用机制
在绝大多数情况下，复合物中单链miRNA与靶mRNA的3’-UTR不完全互补配对，阻断基因的翻译过程，从而抑制该基因的表达。在胞浆中被称为P-bodies区域里有许多靶mRNAs和miRNAs以及许多与mRNA降解相关的酶类，P-bodies是胞浆中的一个特定单位，它包含了许多参与转录后过程的蛋白质：mRNA降解（m RNA degradation）、无义介导mRNA衰退（nonsense-mediated mRNA decay，NMD）、转录抑制及RNA介导的基因沉默（RNA-mediated gene silencing）。因此，尽管P-body成分在mRNA沉默及衰退中起重要作用，但介导基因沉默机制中P-body不是必需品，而只能作为他们活动的结果。关于miRNA作用机制的p-body[17]的作用机制如下图1-1所示：
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图1-1：p-body的作用机制
关于miRNA的另一种作用方式在植物体中较为常见的：当miRNA和mRNA完全配对时，则目的mRNA在互补区的特异性断裂而导致的基因的沉默，这种作用方式与siRNA[18-19]相似。在大部分植物中ORF与它的靶位点几乎完全配对。以siRNA参与RNAi为例进行说明，amiRNA可与RISC结合，作为模板识别信使RNA(mRNA)的靶子，通过碱基之间的互补配对，信使RNA(mRNA)与amiRNA(人工微RNA)的21bp的茎序列结合，置换出正义链。在Dicer酶、ATP和解旋酶及其他微效因子的共同作用下双链信使RNA(dsmRNA)转化成21nt左右的amiRNA，amiRNA继续同RISC形成复合体，与amiRNA互补的mRNA结合，使mRNA被RNA酶裂解，最终阻断基因的下调表达调控，使基因表达沉默。该过程也成为转录后基因沉默机制（PTGS）。该种miRNA沉默方式的具体图1-2示如下：
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第一章 文献综述
图1-2：ami RNA作用机制
1.2.3 人工miRNA的概述
人工miRNA技术最早于2002年由Zeng[20]等应用于哺乳动物细胞系，2004年Parizotto[21]等将其应用于模式植物拟南芥。植物amiRNA与内源天然miRNA相似，具有高度特异性，即amiRNA可以在不影响其他非靶标基因表达的情况下，选择性沉默一个或多个靶基因[22]。近几年研究表明amiRNA可在组成型或组织特异性启动子控制下在活体细胞内高效表达，所表达的 amiRNA不仅可以有效干扰外源报告基因的表达，而且可以有效干扰一个或多个内源靶基因的表达。首先amiRNA运用于人体细胞内，得到了很远的沉默效应。随后运用于植物细胞内也得到了很好的沉默效果。且大量的植物品种特别是很多粮食作物都是多倍体，因此在他们的基因组中存在许多相似度很高的等位基因，amiRNA可以同时干扰多个靶基因的特点，对等位基因功能的研究有很大帮助。此外amiRNA可以有效调控基因表达量从而改变农作物性状，为作物育种提供了一种新技术。Liu [23]应用amiRNA技术下调两个主要脂肪酸脱氢酶基因 ( 硬脂酰载体蛋白脱氢酶和油酰卵磷脂脱氢酶)的表达，从而将棉籽油中的高油酸和高硬脂含量水平降低。咖啡是世界上主要的饮料之一，但咖啡植物里咖啡因含量多，饮用后易引起心慌、失眠、过度兴奋等症状，对于高血脂患者来说容易使血压升高并诱发心脏病．虽然也可以用一些物理和化学方法来降低咖啡中咖啡因的含量，但这不仅增加成本而且咖啡的部分风味也丧失了．Shinjiro Ogita等[24]利用RNAi技术对控制咖啡因合成的基因进行抑制，使材料中的咖啡因含量降低了50％-70％．Norman Warthmann[25]等实验表明：人工合成的miRNA可以特异性的沉默日本晴水稻的三个基因Spl11，Pds和Eui1，且沉默这三个基因可以完全不干扰水稻的其他性状。
人工miRNA除具有高效性、特异性等优点外，还有一大优点，即它能够调节基因表达程度[26]，而且可以获得抑制目标基因的特定程度。我们可以通过使用大量同源于目标
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基因的相近或远缘种‘设计’基因表达的抑制程度。如水稻突变系LGC.1(LOW GLUTELIN Content.1)，研究中由miRNA引起的同源依赖型抑制现象，能降低麦谷蛋白表达水平，给不能消化麦谷蛋白的肾病患者带来了福音[27]．这也是第一个商品化的miRNA品种．
1.2.4 siRNA和miRNA作用机制的关系
SiRNA起初是在植物中发现的[28]。在拟南芥中大部分的小RNA是SiRNA[29],它们参与了各种各样的生理过程，包括病毒防御、异染色质的构建和转基因的沉默等。miRNA和siRNA最主要的区别在于它们的来源不同，但作用机制是相通的。miRNA和siRNA有许多相通之处：①分子长度相同，都是22nt左右。② 两者的形成过程都依赖于Dicer酶，是Dicer的产物，因而二者5’端均是磷酸基，3’端均为羟基。③miRNA和siRNA的合成都是由双链的RNA或者RNA前体得来的。④两者均在功能复合体RISC中发挥效应，部分miRNA自然进入RNAi途径，切割靶mRNA[30]
miRNA和siRNA也有区别：①其根本区别在于miRNA是内源的，在基因组中有固定的基因座位，而siRNA可以是人工合成的，也可以是基因的转录片段或专座片段，关键在于siRNA没有固定的基因座位，而且本身也不是基因组的功能片段是随机产生的，所以加工位点不是保守的。②两者在结构上没有本质的区别，功能分子都是单链RNA，miRNA转录出来的必然是发夹结构，而siRNA可以由互补的双链切割而来，也可以从发夹结构而来。③本质区别在于作用位点上，miRNA有特定的靶位点，是针对于某一类靶mRNA而作用的，而siRNA的作用位点是随机的。④作用方式上没有本质区别，是否降解或抑制靶基因取决于互补程度。⑤在生理功能上：miRNA主要调控发育分化与凋亡，调节内源基因的表达，而siRNA则是抵制外来核酸片段侵入的一种方式，其原始作用是抑制病毒的感染。
miRNA和siRNA的区别总结于下表中：
名称 miRNA siRNA
来源 内源转录体 转基因，病毒RNA或异染色质DNA
大小 约22nt 约22nt 前体 茎环状的pre-miRNA 双链结构的dsRNA
催化酶 Drosha，Dicer或Dicer复合体 Dicer
RISC复合体 含Argonaute蛋白家族 含Argonaute蛋白家族
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