实验六 细菌鉴定中常用的生理生化反应
一、实验目的
1、了解细菌生理生化反应原理，掌握细菌鉴定中常用的生理生化反应的测定方法。 2、通过不同细菌对不同含碳、含氮化合物分解利用情况，了解细菌碳、氮代谢类型的多样性。
3、了解细菌在培养基中的生长现象及其代谢产物在鉴别细菌中的意义。 4、学习各种接种技术。
二、实验原理
各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养基质的分解能力也不一样，因而代谢产物存在差别。以此用生理生化试验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物， 从而鉴别细菌的种属，称之为细菌的生理生化反应。 1、糖（醇）类发酵实验
不同的细菌含有发酵不同的糖（醇）的酶，因而发酵糖（醇）的能力各不相同，产生的代谢产物也不同：有的产酸产气，有的产酸不产气。指示剂溴甲酚紫【pH 5.2（黄色）~ pH 6.8（紫色）】，当发酵产酸时，培养基将由紫变黄。产气可由杜氏小管中有无气泡来证明。
2、甲基红实验（M.R.实验）
甲基红【pH 4.4（红色）～ pH 6.2（黄色）】实验，是用来检测由葡萄糖产生的有机酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。有些细菌分解糖类产生丙酮酸， 丙酮酸进一步反应形成甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基的 pH 降低到 4.2 以下。有些细菌在培养的早期产生有机酸，但在后期将有有机酸转化为非酸性末端产物，如乙醇、丙酮酸等，使 pH 升至大约 6。
3、Voges-Proskauer 实验（伏-普实验，V.P. 实验）
伏-普试验是用来测定某些细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物的能力。某些细菌分解葡萄糖成丙酮酸，再将丙酮酸缩合脱羧成乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在碱性条件下，被氧化为二乙酰，二乙酰与培养基中所含的胍基作用，生成红色化合物为 V.P.反应阳性。
4、靛基质（吲哚）实验
某些细菌，如大肠杆菌，能产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸，产生靛基质，靛基质与对二甲基氨基苯甲酸结合，形成玫瑰色靛基质（红色化合物）。 5、硫化氢实验
某些细菌能分解含硫的氨基酸，产生硫化氢，硫化氢与培养基中的铁盐反应，形成黑色的硫化铁沉淀，为硫化氢试验阳性。 6、明胶液化试验
明胶在25度以下可维持凝胶状态，以固体状态存在，而在 25度以上时明胶就会液化。有些微生物可产生一种成为明胶酶的胞外酶，水解这种蛋白质，而使明胶液化，甚至在4度仍能保持液化状态。 7、淀粉水解实验
细菌水解淀粉的过程可以通过底物的变化来证明，即用碘测定不再产生蓝色。 8、柠檬酸盐利用实验
有的细菌如产气杆菌，能利用柠檬酸钠为碳源，因此能在柠檬酸盐培养基上生长，并分 解柠檬酸盐后产生碳酸盐，使培养基变为碱性。此时培养基中的溴麝香草酚蓝指示剂【pH6.0(黄)～7.6(蓝)】，由绿色变为深蓝色。
三、实验器材
1、仪器和用具
37℃恒温培养箱、试管。
接种环、接种针、酒精灯、试管架、记号笔。 2、材料
大肠杆菌（Escherichia coli）、变形杆菌（Proteus vulgaris）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、产气杆菌（Enterobacter aerogenes）和未知菌种S1。
3、试剂
甲基红试剂、V.P.试剂、吲哚试剂。
上次配制的试管培养基（葡萄糖/乳糖发酵培养基，葡萄糖蛋白胨水培养基，胰蛋白胨水培养基，硫化氢试验培养基，明胶液化培养基，柠檬酸盐培养基），淀粉培养基平板。
四、实验步骤
1. 培养基的配制和准备（前一节课完成）。
2. 培养基的标记：用记号笔在试管上标明培养基的名称、所接种的菌名和实验组号。 3. 取不同培养基，按照实验要求接种对应菌种。
4. 37℃下培养24小时后，对糖类发酵实验、硫化氢实验、柠檬酸盐利用试验实验直
接观察结果。
5. 对以下实验组进行相应处理后再观察结果： a) 甲基红试验加甲基红试剂数滴；
b) V.P.加入40％KOH 5~10滴后，再加入等量的?-萘酚溶液，再在37℃恒温箱保温
30分钟；
c) 吲哚试验加数滴吲哚试剂；
d) 明胶液化试验，将3支试管放入4度冰箱30分钟，取出后观察明胶液化情况； e) 在淀粉培养基平板上的不同区域滴加碘液，观察淀粉-碘液显色反应的结果。
五、实验结果与讨论
（一）实验结果
1、葡萄糖发酵实验
图1 葡萄糖发酵（从左到右依次为大肠杆菌、变形杆菌、未知菌S1、对照）
【结果】葡萄糖发酵中，大肠杆菌、未知菌S1的溶液都变黄，为阳性，其中仅大肠杆菌杜氏小管含气泡；而变形杆菌和对照的溶液不变色，为阴性，杜氏小管均无气泡。 【分析】实验结果说明大肠杆菌能分解葡萄糖产酸并产气，未知菌能分解葡萄糖产酸但不产气。经过与其他组对比和查阅资料，变形杆菌能分解葡萄糖产酸但不产气，实验结果是阴性说明培养基未成功接种上变形杆菌。 2、乳糖发酵试验
图2 乳糖发酵（从左到右依次为大肠杆菌、变形杆菌、未知菌S1、对照）
【结果】乳糖发酵中，大肠杆菌的溶液变黄，为阳性，其杜氏小管也含气泡；而变形杆菌、未知菌S1和对照的溶液不变色，为阴性，杜氏小管均无气泡。
【分析】实验结果说明大肠杆菌能分解乳糖产酸并产气，而变形杆菌和未知菌S1不能分解乳糖或者分解乳糖不产酸也不产气。 3、甲基红（M.R.）实验
图3 甲基红实验（从左到右依次为大肠杆菌、产气杆菌、未知菌S1、对照）
【结果】甲基红实验中，大肠杆菌的溶液为红色，产气杆菌的溶液为橘黄色，未知菌S1的溶液为深红色，对照溶液为黄色。
【分析】实验结果说明大肠杆菌和未知菌S1分解糖类产生有机酸，产气杆菌在培养早期产生有机酸但在后期将有机酸转化为非酸性末端产物。 4、伏-普（V.P. ）实验
图4 伏-普实验（从左到右依次为产气杆菌、未知菌S1、大肠杆菌、对照）
【结果】伏-普实验中，产气杆菌和未知菌S1的溶液为红色，为阳性；大肠杆菌溶液稍有浅红色，对照溶液为黄色，均为阴性。
【分析】实验结果说明产气杆菌和未知菌S1分解葡萄糖产生乙酰甲基甲醇，大肠杆菌分解葡萄糖产生很微量的乙酰甲基甲醇。 5、吲哚实验
【结果】吲哚实验中，大肠杆菌的溶液为红色，为阳性；产气杆菌、未知菌S1和对照的溶液未变红，为阴性。
【分析】实验结果说明大肠杆菌产生色氨酸酶，将色氨酸分解产生靛基质；产气杆菌和未知菌S1不能分解色氨酸。
图5 吲哚实验（从左到右依次为大肠杆菌、产气杆菌、未知菌S1、对照）
6、硫化氢实验
图6 硫化氢实验（从左到右依次为大肠杆菌、变形杆菌、未知菌S1、对照）
【结果】硫化氢实验中，只有变形杆菌的培养基中产生了黑色沉淀，为阳性；大肠杆菌、未知菌S1和对照均未产生黑色沉淀，为阴性。
【分析】实验结果说明变形杆菌能分解含硫的氨基酸，产生硫化氢；而大肠杆菌和未知菌S1不能分解含硫的氨基酸。 7、明胶液化试实验
图7 明胶液化实验（从左到右依次为枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、未知菌S1、对照）