一、试剂准备
细胞裂解： RIPA、PMSF 配胶：
30% Acr-Bis (29:1；在4℃冰箱)、1.5M Tris-HCl （pH8.8）、1M Tris（pH6.8）、10% SDS、10% 过硫酸铵（AP；1.5mL离心管装，在-20℃冰箱）、TEMED 抗体：
一抗、二抗、3%BSA（稀释抗体) 其他：
电泳缓冲液（瓶装粉末，按包装上的要求配即可）、电转缓冲液（瓶装粉末，按包装上的要求配即可）、硝酸纤维素膜（NC膜）、甲醇（泡NC膜）、5%BSA(封闭液)、TBST（一包TBS粉末配成2000mL，加2mLTween-20，为1:1000的TBST）、显影液（两瓶，使用时1:1混合）、加样缓冲液（Loading buffer）、marker
二、蛋白样品制备
1. 单层贴壁细胞总蛋白的提取
（1）倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。
（2） 每瓶细胞加3 ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1 min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
（3）按1ml裂解液加10 μl PMSF（100 mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）
（4） 每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。 （5）裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5 ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。）于冰上裂解15 min。 （6）于4℃下12000 rpm离心15 min。（提前开离心机预冷） （7） 将离心后的上清分装转移倒0.5 ml的离心管中放于－20℃保存。 2. 组织中总蛋白的提取
（1）将少量组织块置于1～2 ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。 （2） 加400 μL单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中，进行匀浆。然后置于冰上。 （3）几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。
（4） 裂解30 min后，即可用移液器将裂解液移至1.5 ml离心管中，然后在4℃下12000 rpm离心5 min，取上清分装于0.5 ml离心管中并置于－20℃保存。 3. 加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取
由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按1操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取：
（1）将培养液倒至15 ml离心管中，于2500 rpm离心5 min。
（2）弃上清，加入4 ml PBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500 rpm离心5 min。弃上清后用PBS重复洗涤一次。
（3）用枪洗干上清后，加100 μL裂解液（含PMSF）冰上裂解30 min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。
（4）将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000 rpm离心5 min，取上清分装于0.5 ml离心管中并置于－20℃保存。 4.蛋白样品处理
按上样缓冲液：样品 =1:4或1:5加入上样缓冲液，100℃煮10min（沸水煮要用封口胶封口）
三、蛋白含量的测定
1. 制作标准曲线
（1）从－20℃取出1 mg/ml BSA，室温融化后，备用。
（2）取18个1.5 ml离心管，3个一组，分别标记为0 mg，2.5 mg，5.0 mg，10.0 mg，20.0 mg，40.0 mg。
（3）按下表在各管中加入各种试剂。
（4） 混匀后，室温放置2 min。在生物分光光度计（Bio-Photometer，Eppendorf）上比色分析。
2. 检测样品蛋白含量
（1）取足量的1.5 ml离心管，每管加入4℃储存的考马斯亮蓝溶液1 ml。室温放置30 min后即可用于测蛋白。
（2） 取一管考马斯亮蓝加0.15 mol/L NaCl溶液100 ml，混匀放置2分钟可做为空白样品，将空白倒入比色杯中在做好标准曲线的程序下按blank测空白样品。
（3）弃空白样品，用无水乙醇清洗比色杯2次（每次0.5 mL），再用无菌水洗一次。 （4）取一管考马斯亮蓝加95 ml 0.15 mol/LNaCl NaCl溶液和5 ml待测蛋白样品？？？？？，混匀后静置2 min，倒入扣干的比色杯中按sample键测样品。
注意：每测一个样品都要将比色杯用无水乙醇洗2次，无菌水洗一次。可同时混合好多个样品再一起测，这样对测定大量的蛋白样品可节省很多时间。测得的结果是5 ml样品含的蛋白量。
四、SDS－PAGE电泳
1. 清洗玻璃板
一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗洁精轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后在烘箱中烘干。（最好用之前再洗净烘干，否则可能会有灰尘导致胶内产生气泡） 2. 灌胶与上样
（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（操作时要使两玻璃底部对齐，玻璃板卡紧后把夹子用力往下压，以免漏胶。）
（2）根据蛋白分子大小，按分离胶配方配分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶，待胶面升到绿带中间线高度时即可（配胶的时候再拍个照）。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（用烧杯配胶和灌胶，灌胶时把架子稍微倾斜，开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿大玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时沿大玻璃板慢慢加入，否则胶会被冲变型。）
（3）当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3 min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干（纸不要塞到玻璃板中间，或者不用吸干也可以，残留一点水没影响）。 （4）按前面方法配5%的浓缩胶（在分离胶凝固过程中配好，但不加TEMED），加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出（也可以用水泡着放4℃冰箱，第二天用）。
（5）用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面向内。）
（6）测完总蛋白含量后，根据所需的蛋白质量和浓度确定要取的样品体积，此时的样品体积很可能是不一样的，可以用RIPA把所有样品补成相同体积再上样。或者可以不测总蛋白含量，直接取相同体积的样品上样，电泳结果用Image J处理，样品中目的蛋白和内参的比值就是一个细胞的目的蛋白的表达量。
（7） 加足够的电泳液后开始准备上样。（新电泳液至少要漫过内侧的小玻璃板。回收电泳液加在外部，到电泳槽的一半即可）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将
加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次，以免交叉污染。注意检查电泳槽是否漏液。 3. 电泳
电泳时间一般1~2 h，浓缩胶电压为80 V，分离胶电压为120V。样品跑至两种胶的交界面或者样品的上表面成直线即可换电压；电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜，电泳液要回收，太脏了就不要了。
五、转膜
1. 转一张膜需准备4~6张7.0～8.3 cm的滤纸和1张7.3～8.6 cm的NC膜。切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。将切好的NC膜置于甲醇浸5min才可使用。 2. 在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。 3. 将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。（一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。）在垫子上垫三层滤纸（可三张纸先叠在一起在垫于垫子上），一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。
4. 要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。（撬时一定要小心，玻板很易裂。）除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。（转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通。）
5. 将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。一般用200mA转移1.5 h。
六、免疫反应（整个过程膜不可以干）
1 . 将膜用TBST洗涤3次，每次5min，移至含有封闭液（5%脱脂奶粉）的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1~2h。
2. 将一抗用3%BSA稀释至适当浓度；剪下适当大小的封闭袋；从封闭液中取出NC膜，用保鲜膜包住，根据不同目的蛋白的大小把膜剪开，放入封闭袋中，加入相应的一抗，排去残留气泡，封好封闭袋；室温下摇床孵育1～3h或4℃孵育过夜；用TBST在室温下脱色摇床上洗3次，每次10 min。
3. 同上方法准备二抗稀释液并与膜接触（可以把一抗是同一种来源的NC膜放在一起孵二抗），室温下孵育1 h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗3次，每次10 min，进行化学发光反应，用TBST洗的同时去512预冷机器至-20℃。
七、化学发光，显影，定影
拍照前将A和B两种试剂在培养皿盖子上等体积混合（一般各1mL就够了）；1 min后，将膜与此混合液充分接触；用曝光机显影，保存图片，分析结果。（曝光机在512，具体使用方法：打开排插电源，机器开关在背面右下方，打开电脑，打开相应软件，点击左上角类似照相机的图标，机器开始预冷，大约需要30min，先把培养皿盖子放入机器里，点击屏幕右边的自动对焦，对好焦后，在培养皿盖子中加入两种显影液混合，把膜放进去显影，点击屏幕右边的曝光，直到你觉得条带亮度满意了就点击屏幕右边的acquire拍摄照片，在点击file、save as、第一个、保存到你想要的文件夹中即可）