一、实验目的和要求
1．学习SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE)的基本原理和操作方法。
2．蔗糖酶分离纯化产物的SDS－PAGE检测分析。 二、实验内容和原理
含α-醇酮基的糖具有还原性．在强碱性溶液中能将四氮唑盐定量地还原为有色甲臜(formazan)，后者在可见光区有最大吸收。该反应在一定条件下可定量完成，且生成的有色甲臜具有一定的稳定性。 三、实验材料和试剂
1．实验材料：
蔗糖酶样品（样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）。
2．实验试剂：
（1）30.8%凝胶贮液：丙烯酰胺(Acr) 30g，甲叉双丙烯酰胺(Bis)0.8g，加水溶解，并加水定容到100ml，过滤。贮于棕色瓶，可在4℃保存一个月。丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺单体及溶液是中枢神经毒物，要小心操作。
（2）分离胶缓冲液：3mol/L Tris-HCl pH8.9。 （3）浓缩胶缓冲液：0.5mol/L Tris-HCl pH6.7。 （4） 10% SDS。
（5） TEMED（N,N,N′,N′－四甲基乙二胺）（增速剂）。 （6） 10%过硫酸铵（引发剂）。 （7）0.1%Triton X-100溶液。
（8）含5%蔗糖的0.2 mol/L乙酸缓冲液（pH4.6）。 （9）0.1 mol/L碘乙酰胺。
（10）现配的含0.2%（w/v）2,3,5-triphenyltetrazolium chloride monohydrate (TTC) 的1mol/L NaOH 溶液。
（11）7.5%乙酸。
（12）5×蛋白质上样缓冲液。 四、实验器材与仪器
1．电泳仪、垂直电泳槽及配件（长短玻璃板各1块、封胶条2条、梳子1个）。 2．微量移液器：10μl、200μl、1000μl。
3．烧杯、长滴管。 4．恒温水浴50℃、100℃。 5．高速台式离心机。
6．离心管（1.5ml、0.5ml）及离心管架。 7．￠15cm培养皿（染色、脱色用）。 五、操作方法和实验步骤
1. 准备电泳装置：电泳槽、电泳仪。 2. 配胶及凝胶的制备： （1）配制凝胶：
注：1. 为去除抑制胶聚合的氧，加入AP前可进行抽气处理；2. 过硫酸铵和TEMED的量应根据室温或聚合情况而定。 （2）凝胶板的制备：
① 分离胶的制备：
按上表配制7.5ml分离胶，混合均匀后将凝胶液加至长、短玻璃板间的缝隙内，再用少许蒸馏水（或水饱和的异丙醇或正丁醇）沿长玻璃板侧壁缓慢注入，约5mm高，以封住胶面，以促使聚合并使胶面平直，约30min后，凝胶与水封层间出现折射率不同的界线，则表示凝胶完全聚合，倾去水封层的蒸馏水。
② 浓缩胶的制备：
按上表配制2.5ml浓缩胶，混匀后将浓缩液加到已聚合的分离胶上方，直至离短玻璃
板上得约0.1cm处，轻轻将样品槽模板（梳子）插入浓缩胶内，约10min后凝胶聚合。小心拔去样品槽的槽板（梳子），将电泳缓冲液倒入上、下贮槽中，电泳缓冲液应没过短板约0.5cm以上，即可准备加样。
3. 样品处理与加样： （1）样品制备：
取蔗糖酶样品（样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）各50ul，分别放入1.5ml离心管中，12000r/min离心15min,收集上清为样品溶液。
（2）样品处理：
将样品溶液分别按体积加入“5×蛋白质上样缓冲液”和10% SDS，比例为样品∶10%SDS ∶5×蛋白质上样缓冲液=3.5∶0.5∶1。
（3）加样：
用微量注射器向样品槽内注入2～5μl样品混合液。如样品浓度较低，可适当增加上样量。
4．电泳：
在电泳槽中加入电泳缓冲液，上槽（加样孔端）接负极、下槽接正极，接电泳仪电源，电流控制在2～3mA/样品孔，一般样品进浓缩胶前，电流控制在10～20mA，待样品进分离胶后，将电流调到20～30mA，保持电流强度不变（恒流），待指示染料迁移至下沿约0.5～1cm处停止电泳。
5. 剥胶：
电泳结束后，取下凝胶模，用专用铲子撬开短玻璃板，将凝胶一角切下做一加样标记，将凝胶板放在￠15cm培养皿内，凝胶用去离子水漂洗2次，每次3分钟。
6．染色：
（1）凝胶浸入0.1%Triton X-100溶液中，静置20min，然后用去离子水漂洗两次，每次5分钟。
（2）凝胶放入含5%蔗糖的0.2mol/L乙酸缓冲液（pH4.6）中，50℃保温30min。 （3）凝胶用去离子水5分钟，然后加入0.1mol/L碘乙酰胺，室温放置5分钟 。
（4）凝胶浸入现配的含0.2%（w/v）2,3,5-triphenyltetrazolium chloride monohydrate（TTC）的1mol/L NaOH 溶液中，100 ℃保温2-3分钟。
（5）当胶上显现红色谱带后，迅速用去离子水漂洗，然后浸入7.5%乙酸中固定30分钟。