芽孢杆菌营养缺陷型的筛选与原生质体融合
（1组，韩小婉，张媛媛，吴亚静）
一、实验目的
1、了解营养缺陷型突变株选育的原理
2、掌握芽孢杆菌氨基酸营养缺陷型的诱变、筛选与鉴定方法 3、了解原生质体融合技术的原理 4、学习并掌握原生质体融合技术
二、实验原理
营养缺陷型：野生型菌株由于某些物理因素或化学因素处理，使编码合成代谢途径中某些酶的基因突变，丧失了合成某些代谢产物(如氨基酸、核酸碱基、维生素)的能力，必须在基本培养基中补充该种营养成分，才能正常生长的一类突变株。
基本培养基（minimal medium，MM）：仅能满足微生物野生型菌株生长需要的培养基，用[－]来表示。
完全培养基（complete medium，CM）：在基本培养基中加入一些富含氨基酸、维生素及含氮碱基之类的天然有机物质，如蛋白质、酵母膏等，能满足各种营养缺陷型菌株生长繁殖的培养基。用[＋]来表示。
补充培养基（supplemental medium，SM）：在基本培养基中只是有针对性的加入某一种或某几种自身不能合成的有机营养成分，以满足相应的营养缺陷型菌株生长的培养基。
筛选营养缺陷型菌株一般具有四个环节：诱变处理、淘汰野生型、营养缺陷型的检出、鉴定缺陷型。 1、诱变处理
本实验选用亚硝基胍(NTG)为诱变剂，在碱性时NTG 能形成重氮甲烷(CH2N)、烷化DNA 而使基因突变：pH5-5.5 时，NTG 形成HNO2，本身也是诱变剂；pH 6.0 时，NTG 本身不变化，可作用于核蛋白而引起诱变效应。NTG 是—种超诱变剂，杀菌力较弱，诱变作用较强，其作用部位又往往在 DNA的复制叉处，易造成双突变。一般选用NTG 处理时，诱变频率较高，可使百分之几十的细菌发生营养缺陷型突变。 2、淘汰野生型
抗生素法：是利用野生型菌株能在基本培养基中生长，而缺陷型不能生长，将诱
变处理液在基本培养基中培养让野生型生长一周，而缺陷型无法生长，加入一定量的抗生素，使活化的野生型杀死，保存了缺陷型。在选择抗生素时，细菌可以用青霉素，酵母可用制霉菌素。
高温杀菌法：利用芽孢杆菌类的芽孢和营养体对热敏感性的差异，诱变后的细菌
形成芽孢后把处在芽孢阶段的细菌移到基本培养液中，振荡培养一定时间，野生型芽孢萌发，而营养缺陷型芽孢不能萌发。此时将培养物加热到80℃，维持一定时间，野生型细胞大部分被杀死，缺陷型则得以保留。
3、检出营养缺陷型
缺陷型在完全培养基上生长良好，而在基本培养基上则不生长，野生型都能生长。 点植对照法：
诱变后的孢子或菌体，经富集培养，涂布分离在完全培养基平板进行培养，待菌落孢子成熟后，用灭菌的牙签或接种针把每个菌落上孢子或菌体分别接到基本培养基和完全培养基平板上的相应位置，同时培养，然后观察对比菌落生长情况。如果基本培养基上不生长而完全培养基相应位置上生长的菌落，可能为营养缺陷型。挑取孢子或菌体分别移接到基本培养基和完全培养基斜面上，进一步复证。该法可靠性强，但工作量大。 影印法：
先将一较平皿直径小1cm的金属圆筒蒙上一层灭菌的丝绒，用金属夹夹住，灭菌。在完全培养基上长出的全部菌落在丝绒上轻轻一压，使之成为印模，标记方位。将基本培养基平皿和完全培养基平皿在标记的同一方位上先后轻轻一压，此菌印模即复印于上。然后将CM和MM在恒温箱中培养。在两平皿相同方位进行比较，即可发现在MM平皿上长出的菌落少于CM平板上的。MM上未长而相应于CM上长出的那几个菌落就可能是缺陷型。此法要求平皿上菌落不能太多，菌落之间应有一定间隔。本法适用于细菌、酵母菌，其次对小型菌落的放线菌和霉菌也适用。 夹层法：
先在培养皿上倒一层基本固体培养基，凝固后涂上一层含菌的基本固体培养基，凝固后再倒一薄层基本固体培养基，培养24h，将出现的菌落标记，然后倒上一层完全固体培养基，再培养。这时第二批长出的菌落就可能是缺陷型。此法缺点是，结果有时不明确，而且将缺陷型菌落从夹层中挑出并不很容易。 限量补充法： 该法有两种情况：
（1）目的是捡出营养缺陷型
方法是将富集培养后的细胞接种到含有0.01%蛋白胨的MM上培养，野生型迅速长成大菌落，而生长缓慢的小菌落可能是营养缺陷型。 （2）目的是定向筛选某种特定的缺陷型
方法是在基本培养基中加入某种单一的氨基酸、维生素或碱基等物质。 4、鉴定营养缺陷型：
生长谱法：指在同一平皿上测定一种缺陷型菌株对许多种生长因子的需求情况。 其原理是：在缺乏某种营养物质的，含有指示剂的培养基上接入某种微生物，再在接菌平板上置入这种营养物质，经一定条件培养后，即可通过指示剂变化情况来判断对不同营养物质的利用情况。该法可以定性，定量地测定微生物对各种营养物质的要求，在微生物育种，营养缺陷型鉴定以及饮食制品质量检测等诸多方面具有重要用途。
单一生长因子：鉴定氨基酸或维生素的营养缺陷型，较为简便的方法是分组测定法。将21种氨基酸，组合6组，每6种不同氨基酸归为一组。
组别 1 2 3 4 5 6
赖氨酸 缬氨酸 苏氨酸 丙氨酸 鸟氨酸 胍氨酸
精氨酸 精氨酸 蛋氨酸 胱氨酸 亮氨酸
氨基酸组合组 蛋氨酸
胱氨酸
亮氨酸 色氨酸 脯氨酸 甘氨酸 甘氨酸
异亮氨酸 组氨酸
苯丙氨酸 酪氨酸 苯丙氨酸 谷氨酸 酪氨酸 色氨酸
谷氨酸 脯氨酸
天冬氨酸 丝氨酸 谷氨酰胺 谷氨酰胺
异亮氨酸 组氨酸 天冬氨酸 丝氨酸
测定方法：缺陷型菌株和基本培养基混合制成平板，把5组或6组生长因子直接加于同一琼脂平板上，或用滤纸片沾取后覆于琼脂平板上，培养后，观察哪一组或哪两组区产生混浊生长圈，即可确定该菌株缺陷的生长因子。
原生质体融合技术(Protoplast Fusion)是将遗传性状不同的两个细胞融合为一个新细胞,使两亲株的整套基因相互重新组合的一种技术。生质体融合技术的关键点有原生质体的制备和再生，原生质体的融合以及融合子的筛选等。据文献知，影响原生质体融合的因素是多方面的，融合剂的浓度、作用时间、阳离子浓度、PH 值以及原生质体的纯度等都会影响融合结果[1]。 1、 原生质体的制备
制备原生质体目前应用最多最有效的方法是酶解法(即用酶溶解掉细胞壁得到原生质体)由于不同微生物的细胞壁成分不同，使用的酶也不同。目前最常使用的酶包括：溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶、溶壁酶以及崩溃酶等。酶浓度、酶解时间和酶解温度对原生质体的释放都有很大影响。除掉细胞壁得到的原生质体中有很高浓度的蛋白质、无机盐及其它维持生命活动的胶体物质，渗透压很高，必须把它放在高渗溶液中，使细胞质膜内外渗透压平衡，才能维持原生质体的稳定
性。
2、原生质体的再生
由于原生质体去除了外层细胞壁，成为一种失去细胞原有形态的球形体，它虽然具有生物活性，但在普通培养基上已无法形成菌落。所以，必须把融合的原生质体涂布于添加渗透稳定剂的高渗琼脂培养基上，或者把原生质体悬液混合在培养基中，进行琼脂夹层培养，使其再生细胞壁，才进而发育成菌落。提高原生质体再生率是获得融合子的必要条件，影响再生率的因素较多，主要有菌龄、再生培养基成分及渗透压等。 3、原生质体形成率与再生率的计算
原生质体的形成率与再生率是反映原生质体制备质量的两个重要指标。在进行融合前首先要对原生质体的形成率和再生率进行测定。一般的计算方法为： 形成率=（未经酶处理的总菌数—经酶处理后的剩余菌数）/ 未经酶处理的总菌数×100%
再生率= (再生完全培养基平板上的总菌数—低渗处理后的剩余菌数）/ （未经酶处理的总菌
数—低渗处理后的剩余菌数）×100% 4、原生质体融合 （1）化学融合法
目前最常用的是PGE助融法。将两亲本的原生质体等量混合在高渗液中, 加入PGE助融。振荡促使原生质体融合。关于PGE助融的作用机理一般认为PGE使原生质体的膜电位下降， 然后通过Ga2+ 交联而促进凝集。本次实验采用化学融合法。聚乙二醇(PEG)是一种多聚化合物，不同种类微生物对PEG分子质量的要求不尽相同，细菌常用1．5 ku～6 ku[3]。
（在融合时间上， 以15-20min比较适宜， 时间过长，效果反而不好。这可能与PGE对原生质体的毒性和原生质体对有机质稳定剂的敏感性有关。由于PGE的加入，原生质体间的粘着即强烈地发生， 融合立即就开始了， 且PGE在高浓度下有毒， 所以PGE的处理时间不需太长[2]。） （2）电融合法
电融合技术是利用直流或交流电场的作用，迫使两亲本原生质体融合。包括下述过程：细胞在电场中极化成偶极子，沿电力线排列成串珠状，两极间的高压电脉冲击穿紧密接触的细胞质膜。在细胞膨压的作用下完成融合。优点：电融合条件可控，融合率高，无毒。缺点：设备条件要求高，费用较高[4]。 （3）激光诱导融合法
利用激光束对相邻两个细胞接触区的原生质膜进行穿孔，使两个细胞的基因进行交换重组。目前利用这种方法诱导动、植物细胞的原生质体融合已有大量报
道。
5、融合子的筛选
原生质体融合后，真正的杂合二倍体是极少数的，大多数异核体会产生亲型分离子。如何有效地筛选出具有优良性状的融合子是至关重要的。选择融合子的方法很多，主要方法有：利用营养缺陷型作为遗传标记，利用抗药性标记，灭活供体法，利用荧光染色法选择融合子等。利用营养缺陷型作为遗传标记（本次采用）是一种传统有效的方法。假设两亲株的的遗传标记为营养缺陷型A+B- 和A-B+则其重组子的原养型为A+B+,由于遗传互补,在高渗基本培养基上能够再生,从而能够筛选出融合子。但这些标记不仅在遗传上不稳定，而且还往往会引起许多不利于生产的性状突变。
注：影响原生质体制备的主要因素 酶用量：lysozyme 0.1-0.2mg/ml
酶解温度：一般35℃-37℃或45℃，细菌最适温度28℃-37℃ 酶解时间：20min-7h左右，一般细菌酶解时间较短。
pH值：细菌如枯草芽孢杆菌最适pH7.5-8.5，低于pH7对原生质体的制备率影响较大。
三、实验材料
氨基酸营养缺陷型的筛选 菌种：芽孢杆菌。 培养基：
(一)筛选氨基酸营养缺陷试验用培养基 1.完全培养基(CM)
葡萄糖 0.5 g，牛肉膏 0.3 g，酵母膏 0.3 g，蛋白胨 1 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，蒸馏水 100 mL，pH 7.2，100 Pa 灭菌20min。 2.基本培养基(MM)
葡萄糖 0.5 g，(NH4)2SO4 0.2 g，柠檬酸钠 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.02 g，K2HPO4 0.4 g，KH2PO4 0.6 g，重蒸水 100 mL，pH 7.2，100 Pa 灭菌20 min。 3. 补充培养基(限制培养基)
(1) 基本培养基加一定浓度完全培养基在液体基本培养基中，加入0.1%—0.5%的完全培养基及2%琼脂。 (2) 基本培养基加混合氨基酸溶液
在配制基本培养基时，将20 种氨基酸分别依次缺少一种而使其中含有其他19 种氨基酸然后接入待测菌，在哪种培养基上不长菌，就是缺哪种氨基酸的营养缺陷型。 (二)试剂配制