7.3 参考值的分组
在实际分析受试者之前，为确保实际操作过程分析的可靠性，必须充分考虑在不同组别设立不同参考区间的可能性。仅仅根据性别不同或不同年龄组来进行设置参考区间的范围不一定是正确的，除非有临床意义，和/或者是生理学上的原因。当然，对于一个新的分析样本来讲，决定是否进行分组设置所需要的信息也许根本无法得到。然而，如果这些情况都能满足，且根据性别或年龄等其他类型的分组的每组例数在120例以上，那么进行这些形式的分组是可以尝试的。
一般认为只要两个分组之间测得的均值的区别具有统计学显著意义（在 5% 或 1% 可信区间），那么每个组别就能保证其自身的参考值区间。不过，任何即使不具有临床意义的差值，只要样本含量足够大，都是具有统计学意义的。Sinton 等[17]认为一般不进行单独的参考区间的评估，除非组别间均值的差异达到25％，相当于从总的样本含量中估算出的参考区间的95％。
相反的，小组委员会的部分研究工作（Harris，Biyd等人）显示，较小的组间均值的差别可以导致高于参考值范围上限和低于参考值范围下限，各自分布的百分比与2.5％比较有明显的差异。这一研究意味着将样本作为一个总体测得数值，有可能可以得出组别之间敏感性和特异性的主要偏差，也可以出现严重阻碍作为有诊断意义的过程的一部分的试验结果的解释。(如果需要这个问题更深层次的讨论或有关确定参考区间的总论，请参阅Hanis EK, Body JC：医学实验室确定参考值的统计学基础，1995)。
此外，如果组别间均值是相同的，但标准差之比是1.5或多些，这种情况也能成立。同样的道理，分布范围较宽的组别在两端的延伸范围实质上超过较窄的组别。然而，这样的比率很少出现。在许多实际的例子当中，尽管组别间的均值在统计学有显著性差异，但标准差大致还是相同的。
综合上述研究，小组委员会推荐结论如下：首先，在实际参考总体的样本确定前，同试验分析方面相关的组别的参考区间的各种可能性都必须进行考虑。根据有关的生理学信息和具有临床潜在的实际意义进行区间的分隔也应该同时进行评价。
如果这样的评价显示可能存在组别差异性，而且可能具有临床意义，那么每组参考样本含量至少需要120例。这需要两个步骤完成，首先设置每组大约60例样本，对于二分类（例如，男性和女性或两个年龄组）来讲，两组间均值差异的统计学意义应该通过标准差的一般公式（公式1）进行检测。
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其中x1 和x2 分别是两个组别的均值, s12 和s22 分别两组的标准方差, n1和n2则是各组的参考样本含量。假设每组至少60个样本含量, z-检验实质上是一个非参数检验，并能适用于不论是否是正态分布的原始数据。然而，如果原始数据分布严重不对称，通过一个简单的转换，例如对数转换，产生一个接近正态分布的并更适合于z-检验的数据。
统计的Z数值必须同“危急值” z*相比较。“危急值” z*的计算公式（2）如下：
Z
*
＝3（naverage/120）
1/2
＝3【（n1+n2）/240】
1/2 (2)
另外, 如果标准差（如S2）较大，应当检查看它是否大于1.5倍的S1, 或者检查看看， S2/(S2 - S1) 是否小于3。
例如, 假设在采样的第一个阶段末期，收集的平均每组样本含量是60个。然后,如果计算出的z值超过危急值z*=3(60/120)1/2=2.12, 或如果较大的标准差超出1.5 倍的较小的标准差, 那么每组抽样至少应该扩大到120个样本含量。同时重复进行Z检验和标准差的比较。如果此时每组平均样本含量是120, z* = 3 。如果平均每组样本含量超出120例, 危急值的Z检验的统计值将大于z* = 3。例如,如果平均每组样本含量是500, 危急值将是z* = 6.12 。
有一点必须注意, 如果Z值超出Z*, 或者较大标准差超出1.5倍较小的, 那么不论z值是多少,均假定两个组别的参考区间的差别有临床实际意义，必须计算出每组的参考区间。如果上述情况不存在，那么只需计算总体样本含量的参考区间，提供一个参考区间统一使用。
当超过两个组进行比较时，问题要更加复杂。这时我们可以寻找统计学方面的专家进行咨询，获得帮助。Harris等也遇到类似情况，并给出以下建议: 对于三个或更多的组别,推荐使用方差分析(ANOVA)来进行统计处理。然而，所有组别均值不同的统计学上的显著性，事实上都取决于两组间均值的差别或者一个组同总体样本间的区别。因此方差分析 (ANOVA) 的F-检验须同时进行配对T检验。T检验可对其他检验形式在0.05的概率水平进行检验，从而保证发现样本间真实的区别的高概率水平。普通的方差分析 (考虑不等样本量)和配对均值分析的T检验(或其他检验)，在许多常用的统计程序包都可以有( 如SAS分析系统)。
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但是必须明了，任何配对均值间的差异检验如果是显著的，就必须用z-检验重新进行检验。
以上推荐的统计学检验和准则，也可用于解决诸如一个实验室确定的参考区间是否可以不作任何变动，直接在别的实验室应用等问题(详见第8节) 。
7.4 举例说明
如直方图2 和3所示，分别代表检测1987～1988年间弗吉尼亚大学医学院学生的血清样本中的钙和丙氨酸转氨酶(ALT)值。原始数据依次列举在表5和表6中，包括了从每两组中统计得到的120个分析数据，年龄段在20至30岁的男性和女性。钙含量的直方图大致呈现正态分布；但ALT的数据图明显向右偏移。女性ALT 65 U/L 的极端值(表6)并不违反1/3规则的极值[(65 -47)/60 小于1/3]，所以应该保留。ALT值的对数分布近似正态分布，两组数据分析结果显示男性比女性的高，而且根据性别进行参考区间的设置是有意义的。
图2 男、女血清钙直方图
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图表5 240个医学生由性别差异的钙的频数分布
图表6 204个医学生有性别差异的丙氨酸转氨酶的频数分布
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n 表示观测的参考值数量，这组参考数据是用于计算95%的参考区间。观测值首先按次
序排列好(如按大小排序)。用r 代表观测值的级别(排列最小值为r= 1; 最大值为 r = n) 。非参数方法要计算两种值，即最低的参考限 r1(第2.5个百分位数)作为相应的观测值r= 0.025 (n + 1),和最高参考限r2 (第97.5个百分位数)作为相应的观测值r =0.975 (n + 1) 。因为r1 和r2 的值通常不是整数, 在相应级别任何r1 和r2一侧的参考限值的计算也就会增加了普通的小数点数据运算。但是在这些样本中，因为n =120, 所以通过四舍五入方法后
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