大片段DNA载体。
BAC载体已广泛应用于基因组文库的构建及筛选、基因组测序、新基因的发现、克隆作图、BAC微阵列、转基因和动物品种资源保存等方面。 4 如何组建克隆重叠群？
染色体步移法（chromosomal walking）：先从基因文库的一个克隆开始，然后从文库中寻找与之重叠的第二个克隆，再继续确定第三个克隆，依次类推。 克隆指纹法：指纹是指确定DNA样品所具有的特定DNA片段组成，一个克隆的指纹表示了该克隆所具有的指定序列的特征，可以同其他克隆产生的同类指纹比较。克隆指纹法的原理是，如果2个克隆彼此重叠，它们一定含有相同的顺序。
五 Sanger测序原理与组装
1 Sanger双脱氧末端终止法的原理
核酸模板在核酸聚合酶、引物、四种单脱氧碱基存在条件下复制或转录时，如果在四管反应系统中分别按比例引入四种双脱氧碱基，只要双脱氧碱基掺入链端，该链就停止延长，链端掺入单脱氧碱基的片段可继续延长。如此每管反应体系中便合成以共同引物为5’端，以双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后，分四个泳道进行电泳。以分离长短不一的核酸片段（长度相邻者仅差一个碱基），根据片段3’端的双脱氧碱基，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。
2 基因组框架图、完成图
框架图能覆盖基因组常染色体区域90%，覆盖基因区域95%，contig N50达到5 kb，scaffold N50达到20 kb，单碱基错误率在十万分之一以下。
完成图能覆盖基因组常染色体区域95%，覆盖基因区域98%，contig N50达到
20 kb，scaffold N50达到300 kb，单碱基错误率在十万分之一以下。 3 Phred-Phrap-Consed 软件包中各软件的作用
Phred执行如下任务：读trace文件，调用bases，分配属性值到bases，生成输出文件；Phrap组装鸟枪法DNA序列数据；Consed浏览和编辑Phrap组装产物。 4 lander-waterman model 及其原理
一段序列没有被覆盖的概率P0=e-（LN/G）或者P0=e-c；
L片段的长度，N总的序列数量，G总长度，LN/G一个碱基被覆盖的平均次数，P0是指在平均次数为LN/G的情况下这个碱基一次没有被覆盖的概率，1-P0即可计算出一个碱基被覆盖的概率。令c=LN/G，计算某一点不能被测序的概率P0= e-c，总的gap的长度=G e-c，总的gap的数量=N e-c。 5 Pair-end reads, Mate-pair reads, Contig, Scaffold, N50 size Reads：pair-end reads 基于序列文库克隆两端的序列读框；
mate-pair reads 基于插入片段大于mate-pair文库克隆两端的序列读框； Contig(重叠群)：指相互间存在重叠顺序的一组克隆； Scoffold：连接非重叠的重叠群；
N50：Reads拼接后会获得一些不同长度的Contigs。将所有的Contig长度相加，能获得一个Contig总长度。然后将所有的Contigs按照从长到短进行排序，如获得Contig 1，Contig 2，Contig 3...………Contig 25。将Contig按照这个顺序依次相加，当相加的长度达到Contig总长度的一半时，最后一个加上的Contig长度即为Contig N50。
六 二代测序原理与组装
1 454测序仪的Pyrosequencing原理
焦磷酸测序(Pyrosequencing) 原理建立的高通量基因组测序系统，依靠生物发光进行DNA序列分析的技术：在多种酶的协同作用下，当碱基正确配对时，发生一个合成反应和一个化学发光反应的偶联，释放光信号。光信号实时被高灵敏度CCD捕获，最终达到测序的目的。
具体步骤是：①测序引物与DNA单链杂交；②在DNA聚合酶催化下，dNTPs在引物3’端聚合并延长；③ATP硫酸化酶催化PPi和APS生成ATP；④荧光素酶催化ATP氧化荧光素u；⑤检测光信号；⑥腺苷三磷酸双磷酸酶催化ATP和dNTP去磷酸；最后通过光信号检测计算得出对应的核酸类型。 2 Illumina GA/HiSeq System 的桥式扩增
“DNA簇”和“可逆性末端终结（reversible terminator）”
① 文库制备 将基因组DNA打成几百个碱基（或更短）的小片段，在片段的两个末端加上接头(adapter)。
② 产生DNA簇利用专利的芯片，其表面连接有一层单链引物，DNA片段变成单链后通过与芯片表面的引物碱基互补被一端“固定”在芯片上。另外一端（5’或3’）随机和附近的另外一个引物互补，也被“固定”住，形成“桥 (bridge) “。反复30轮扩增，每个单分子得到了1000倍扩增，成为单克隆DNA簇。DNA簇产生之后，扩增子被线性化，测序引物随后杂交在目标区域一侧的通用序列上。 ③ 测序 Genome Analyzer系统应用了边合成边测序（Sequencing By Synthesis）的原理。加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP。 这些核苷酸是“可逆终止子”，因为3’羟基末端带有可化学切割的部分，它只容许每个循环掺入单个碱基。此时，用激光扫描反应板表面，读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类。之后，将这些基团化学切割，恢复3'端粘性，继续聚合第二个核苷酸。如此继续下去，直到每条模板序列都完全被聚合为双链。这样，统计每轮收集到的荧光信号结果，就可以得知每个模板DNA片段的序列。目前的配对末端读长可达到2×50 bp，更长的读长也能实现，但错误率会增高。读长会受到多个引起信号衰减的因素所影响，如荧光标记的不完全切割。 ④ 数据分析 自动读取碱基，数据被转移到自动分析通道进行二次分析。
① 每轮测序反应加入四种带有荧光标记的dNTP，末端带有可以被去除的阻断基团；
② 每轮反应只能整合一个核苷酸，仪器读取相应的荧光信号； ③ 信号读取结束，用化学方法去除阻断基团，进行下一轮测序反应。 3 454 GS FLX、Hiseq-2000 与SOLID 5 测序仪各有什么优缺点
454 GS FLX是焦磷酸测序，Hiseq-2000是合成法测序，SOLID 5是连接法测序； 读长：454 GS FLX> Hiseq-2000> SOLID 5； Reads数： SOLID 5> Hiseq-2000>454 GS FLX；
应用：454 GS FLX读长最长，便于拼接，因此在de novo测序方面有很大优势；SOLID 5虽然读长很短，但是Reads数最多，而且ABI独有的双色球编码技术，使得每个碱基都会被读取两遍，准确率很高，因此SOLID 5在检测SNP、转录组测序、ChIP-Seq等方面很有优势；Hiseq-2000的读长和Reads数均位于中间，比较适合于基因组学研究（测序和注释）以及功能基因组学（基因表达及调控，基因功能，蛋白核酸相互作用）研究。
七 测序数据评估
1 Phred 20、40代表什么意思
Phred数值20代表100bp中有一个错误。Phred数值40代表10000bp中有一 个错误。
Phred效果评估的方程是q = -10 x log10 (p)，q -quality value（质量评价）p -estimated probability error for a base call（产生一个base call误差的概率） q= 20 means p=10-2(1 error in 100 bases) q= 40 means p=10-4 (1 error in 10,000 bases)
2 Fastq 是什么格式