5、细菌的新霉素磷酸转移酶基因
提高外源基因表达的策略： 1、构建高效表达的转化载体 2、克服转基因的失活
3、利用位点特异性重组系统 4、利用去甲基化试剂5—氮胞苷
植物基因转化受体系统： 1、愈伤组织再生系统 2、直接分化再生系统 3、原生质体再生系统 4、胚状体再生系统 5、生殖细胞再生系统
克服质粒丢失的方法：
质粒分离的不稳定性指质粒缺陷性分配引起的质粒丢失现象。
分配功能区Par能够保证质粒分子在每次细胞周期中都能准确分离，并均匀的分配到子细胞中去。 克服方法：
1、将Par克隆岛表达载体 2、对无质粒细胞进行反选择
基因工程的选择标记基因的选择原则：
1、标记基因产物不会干扰受体细胞正常的新陈代谢活动，同时，转化细胞应具有抵抗选择剂的能力。
2、使用的选择剂不明显影响转化细胞的生长发育。 3、选择过程花时短，选择剂的用量低。
4、应尽量选用被证明环境释放安全的选择基因。
Bt蛋白的杀虫机制
Bt基因编码的内毒素是以无毒的原毒素形式存在，当敏感的昆虫在其取食转基因植物时，Bt原毒素随之进入昆虫的消化道，在昆虫的中肠道被肠胃碱性蛋白酶水解成毒素分子，这种活化的毒素分子与中肠上皮细胞表面的糖蛋白结合，其N端区域插入细胞膜，形成小孔，破坏K通道，引起细胞内外的渗透压失衡，致使细胞因膨胀而破裂，结果昆虫便停止取食而最终死亡。
原毒素的溶解，原毒素的蛋白酶水解，毒素分子穿过围食膜，毒素分子与受体结合，毒素分子插入膜中，小孔的形成，中肠细胞失去离子平衡裂解。
要证明外源基因成功地在受体生物中整合和表达，应进行哪些检测： 1、外源基因整合分子生物学鉴定
PCR扩增，Southern斑点杂交，Southern印迹杂交，Southern原位杂交，PCR-Southern杂交 2、外源基因表达的检测
转录水平上：Northern杂交（斑点，印迹杂交）
翻译水平上：生化反应检测，免疫学检测，生物学活性的检测
利用基因工程控制果实成熟的方法：
Met—SAM—ACC（ACC合成酶）—乙烯（乙烯形成酶） 1、ACC合成酶反义基因及其应用 2、乙烯形成酶反义基因及其应用 3、ACC脱氨酶基因及其应用 4、PG反义基因的应用
耐除草剂基因工程主要由两种策略：
1、修饰除草剂作用的靶蛋白，使其对除草剂不敏感
2、引入酶或酶系统，在除草剂发生作用前将其降解或解毒
草甘膦
草甘膦特异性地抑制植物和细菌中的莽草酸羟基乙烯转移酶（EPSPS）的活性。EPSPS是芳香族氨基酸合成途径的一个酶。在植物中，大部分EPSPS的活性中心位于叶绿体中。 莽草酸途径被抑制，造成植物芳香族氨基酸的缺乏。 EPSPS合成酶的过量表达
对除草剂不敏感的EPSPS合成酶 除草剂的解读基因
磺酰脲类除草剂
磺酰脲类除草剂抑制支链氨基酸合成过程中一个关键酶——乙酰乳酸合成酶（ALS）而抑制蛋白质的合成。
在植物和微生物中，ALS催化支链氨基酸生物合成中共同的第一步反应。 分离对磺酰脲类除草剂不敏感的ALS基因，并转化植物。
草丁膦
草丁膦强烈地抑制谷氨酰合成酶（GS）的活性而造成氨在植物的积累毒害。
乙酰CoA转移酶催化乙酰CoA与草丁膦的游离氨基结合，使草丁膦变成乙酰草丁膦，从而失去除草剂的活性。
阿特拉津
三嗪除草剂的主要代表，其主要作用是抑制植物叶绿体中的光合作用。
与质体醌竞争32kD蛋白的同一结合位点，阿特拉津与32kD蛋白结合后，就被抑制了PSⅡ电子传递中质体醌。
利用点突变耐阿特拉津的psbA基因。
基因工程建立的基础：
1、理论基础a、DNA是遗传信息的携带者 b、DNA能自我复制和传递 c、中心法则的提出和遗传密码子的通用性
2、技术基础 a、工具酶：限制性内切酶、连接酶 b、质粒载体 c、受体的转化方法
植物来源的抗虫基因转入原始品种或其近缘种往往达不到理想的抗虫效果，简述其原因。
昆虫和植物之间存在食与被食的关系，昆虫和植物进行进化，植物来源的抗虫基因对取食昆虫而言类似于抗原，能诱导产生对抗虫基因产物不敏感的靶酶，或超量表达靶酶，或者表达解毒基因，降解抗虫基因的产物。
植物病毒载体的应用潜力
1、个别病毒可以较高频率通过种子传递到下一代，可以避开质粒载体转化时的组织培养植株再生的困难。
2、多年生以及那些用营养器官进行繁殖的一年生植物（如土豆），用病毒接种是可行的 3、克隆基因的功能验证
4、密集种植的温室栽培植物如番茄等，用人工接种，在经济上是可以承受的。 5、用植物细胞表达外源基因产物
从安全性考虑，理想的转基因方法应该满足哪些条件。 1、不发生基因漂移
2、不影响靶生物，非靶生物和生物多样性 3、不影响农业生态和自然生态环境 4、无标记基因，不影响食品安全
动物基因工程的制约因素有哪些 1、动物细胞全能性的局限性 2、动物细胞组织培养的技术限制
3、转基因动物胚胎细胞需放入动物体内才能发育成新的个体，花时长 4、动物繁殖速度一般较慢 5、转化方法的限制 6、载体的限制
植物转基因的操作程序
外源基因的分离克隆——载体的选择和构建——基因转化受体系统的建立——基因转化——筛选转化体——检测外源基因的表达——表型性状的鉴定——遗传学分析后代——目标性状的传递和稳定性— 农杆菌介导的转化：
外源基因的分离——克隆到载体上——建立基因转化受体系统——农杆菌的敏感性试验及菌种的选择——外植体的预培养——外植体的接种和培养——选择培养转化细胞——外源基因整合和表达检测——外源基因提高表达策略
抗植物病毒的基因工程策略： 1、CP基因及应用 2、复制酶基因及应用 3、病毒卫星RNA的利用 卫星RNA的特点;
A、在其相伴病毒中发现
B、按照相伴病毒的复制和传播机制，从一个植株传到另一个植株 C、它们不与其相伴病毒的核苷酸序列同源，对病毒的复制也不起作用 D、卫星RNA能改变其相伴病毒的致病力
4、核糖体失活蛋白RIP的利用
一类能抑制蛋白质生物合成的蛋白，广泛存在于高等植物中。
Ⅰ型是单链碱性蛋白质，分子量约为30kD，可以带有糖基也可以不带糖基但其生物活性都一样，都具有抑制无细胞蛋白质合成的作用，对完整细胞或动物呈无毒或低毒。
Ⅱ型由A、B两条肽链通过二硫键组成的二聚体，其分子量约60kD，其A链与I型同源呈酸性或碱性，是毒性分子，B链是凝集素，能结合到细胞膜表面并协助A链进入细胞。
Ti质粒改造策略： 一元载体系统：
去除野生型Ti质粒T—DNA中的Onc基因，引入一段过程操作的小质粒序列，保留T—DNA的边界序列。
将外源基因装载到小质粒上，然后把载有外源基因的小质粒通过一定的方法导入农杆菌，利用Ti质粒与小质粒的同源重组，将外源基因引入T—DNA，制成用于转化的一元载体转化菌株。
双元载体系统：
大Ti质粒的改造，主要是去除T—DNA上的Onc基因，甚至完全消除T—DNA，保留Ti质粒上的其他部分，并保留在受体菌体中。小质粒只带有T—DNA、复制起点和选择标记基因，有些仍保留VirG序列，并在T—DNA上引入多克隆位点。
基因的定点插入技术，通过在转染细胞中发生的外源基因与核基因组目标基因之间的DNA同源重组，使外源基因定点地整合到核基因组的特定位置上，从而达到改变细胞遗传特性的目的。
在外源定点插入基因与内源核基因组目标基因之间，必须存在一段适当长度的同源的DNA序列。
插入型和置换型
1、应用基因定向插入技术，能够将体外修饰改造的突变基因或某种新的外源基因，取代受体细胞核基因组上的目标基因，使基因组获得新的遗传信息，以便使科学工作者能够相当有效地检测基因的功能。
2、应用基因定向插入技术，也可以在核基因组的目标基因序列附近，插入一个具相同调控序列的同源基因拷贝。如此，既可形成重复基因，提高表达效率和相关的蛋白质产量，又可能不会破坏目标基因及其邻近基因的功能。
3、利用基因定向插入技术，还可以在核基因组内部增加一段DNA序列，或造成序列缺失，甚至是单碱基定点突变等，从而达到抑制或纠正目标基因的功能，为遗传疾病的基因治疗提供技术途径。
动物病毒的特点：
1、动物病毒含有能够被真核细胞识别的有效地启动子。
2、有许多动物病毒，在其感染周期中都能够持续地复制，使其基因组拷贝数达到相当高的水平。
3、病毒具有控制自我复制的顺式元件和反式作用因子。
4、有些动物病毒，在它们的复制过程中能高效稳定地整合到寄主核基因组上。
5、病毒的外壳蛋白质能够识别细胞接收器，因此外壳蛋白可作为感染剂能够将外源基因高效地导入寄主细胞。用病毒外壳蛋白质包装重组质粒DNA形成的假病毒颗粒，即构成了一
种高效地转化体系。 A、晚期区段取代载体
缺失了整个晚期区段功能的SV40病毒，同可互补这段功能的一种温度敏感ts的辅助病毒混合感染时，仍然能够增殖。因此，可以通过取代晚期区段的途径构建SV40病毒载体。最常用的辅助病毒是tsA突变体，它合成一种温度敏感的T抗原。 B、早期区段取代载体
通过由一种辅助病毒提供抗原，被这种取代载体感染的受体细胞，便会出现正常的裂解周期。
重组的病毒——质粒载体
1、含有完整早期区段和复制起点的病毒—质粒载体
由病毒的早期区段和复制起点同大肠杆菌的质粒分子重建而成。 2、微型病毒复制子—质粒载体 含有SV40复制起点的DNA片段
Southern 印迹杂交检测转基因植物外源基因整合位点和拷贝数的原理 重叠探针杂技，并以转化的外源基因不同拷贝数为对照。
转化植株基因组DNA用限制性内切酶消化时，外源DNA序列会产生四种片段。 1、内部片段：由外源DNA内的切点产生 2、边界片段：是外源DNA插入的末端片段
3、复合片段：这种片段与T—DNA的左边界及右边界表现同源
4、重新编排的序列：这种限制性片段可能来自T—DNA的重新编排或异常整合。也可能是正常整合后发生
如何评价一个转基因体系的优劣？
1、从外源基因分离和克隆的角度，基因序列是新的，要求有氨基酸的改变
2、从载体的角度，操作简单、安全，对受体不造成伤害，也不影响受体细胞正常的新陈代谢和发育，转化率高，应能让外源基因高效表达，且产物不被降解。筛选转化体容易、花时短、选择试剂成本低，转基因作物验证容易
3、从受体的角度，来源丰富，培养简单。容易建立感受态。培养基来源广泛，成本低，不产生嵌合体，遗传稳定，对选择抗生素敏感，易于离体培养，具有高度重复性
4、从转化方法的角度，操作简单安全，转化率高，花时短，不受宿主基因型限制，不造成无性系变异
从哪些方面考虑，转基因应优先导入细胞器？
1、从安全性考虑，优先导入细胞器可以避免因花粉漂移造成的危险，且不会破坏细胞基因组
2、从某种具体要素而言，例如要对细胞器中的基因进行改造，提高细胞器的作用功能 3、从操作简单上考虑，质粒载体转入细胞器，不整合到基因组上，实现外源基因高效表达 4、从细胞修复上考虑，可导入外源基因修复细胞器的功能
提高作物产量的转基因策略：
1、向C3植物导入C4型PEPCase基因 2、提高Rubisco的光合系数
3、提高磷酸蔗糖合成酶的活性，磷酸蔗糖合成酶基因的应用
4、提高淀粉合成酶—ADPG焦磷酸酶的活性。ADPG焦磷酸酶基因的应用提高糖原的积累速度进而提高淀粉的含量
5、延长叶片的光合作用功能期
哺乳动物细胞基因敲除实验基本过程
1、根据受体细胞核基因组中待敲除的目标基因之核苷酸序列的结构特征，在体外构成一种具有失活基因或纠正基因的DNA片段。然后将此片段克隆在一种具有选择标记基因的置换型基因定向插入载体上
2、将此载体经适当限制酶消化作用而被线性化之后，转染给培养的小鼠ES细胞。由于定向插入DNA片段的两侧与目标基因两端之间存在同源的DNA序列，因此，它课通过同源重组置换核基因组中的具功能活性的目标基因，也就是活把目标基因敲除掉 3、应用正负选择法分离出已成功地敲除掉了目标基因的ES细胞克隆，这样的ES细胞系也叫做突变的ES细胞
4、挑选生活力旺盛的突变的ES细胞，体外注射到超数排卵的供体小鼠的胚泡中。胚胎干细胞转移
5、将此胚泡转移到受体母鼠，亦称养母的子宫中。由此发育长成的当代转基因小鼠，其个体中含有一定比例的来自ES细胞的细胞群体，称为嵌合鼠。实验中所用的供体小鼠、受体小鼠和提供ES细胞的小鼠，三者均应是属于近交系
目的基因克隆策略： 1、图位克隆法
2、mRNA差异显示法（未知序列基因克隆） 3、基因组扣除杂交法（未知序列基因克隆） 4、转座子、T—DNA标签法 5、同源序列法 6、功能互补法