国家自然科学基金申请书 2010版
E-cadherin与Pyk2相互作用(见研究基础部分)，而且二者功能上密切相关。E-cadherin作为一种细胞黏附分子在细胞黏附、细胞迁移和接触抑制方面具有作用。而Pyk2能通过各种信号途径参与调节细胞黏附、扩散和迁移等过程。因此，二者在功能上是有互相作用基础的。
考虑到Pyk2是一个激酶蛋白，且前期实验结果提示Pyk2激酶区域结合E-cadherin，因此有两种可能，一种是Pyk2磷酸化E-cadherin，另外一种是E-cadherin抑制Pyk2激酶活性。我们认为第一种可能性较大。根据文献报道，Pyk2能磷酸化E-cadherin的同源蛋白VE-cadherin并且抑制其与Catenin、P120等形成复合体，从而影响细胞迁移。E-cadherin与VE-cadherin同源性很高，理化性质相似，Pyk2能够磷酸化VE-cadherin应该就有可能磷酸化E-cadherin。因此我们有理由推测，由于肿瘤始动因素的作用，Pyk2表达增多，活性增强，从而磷酸化E-cadherin，导致E-cadherin降解，最终使细胞迁移性增强。我们上述实验设计基本基于这个逻辑。磷酸化实验证实Pyk2磷酸化E-cadherin，导致E-cadherin蛋白减少。细胞迁移实验和动物实验设计逻辑是通过Pyk2过表达，检测E-cadherin磷酸化增强，蛋白量减少，导致细胞迁移增强或者肿瘤转移增加；RNAi抑制Pyk2的表达，则出现相反的结果，E-cadherin磷酸化减弱，蛋白量增加，导致细胞侵袭性减弱和肿瘤肺转移减少。事实是否如此，需要实验来证明。
申请人以前的工作曾发现钙粘附蛋白家族的另外一个成员γ- Protocadherins能够抑制Pyk2的活性，因此从逻辑上讲也不能完全排除第二种可能性，即E-cadherin抑制Pyk2的磷酸激酶活性。如果是这样的话，则可能的假设是：在正常细胞中，E-cadherin抑制Pyk2的活性，在肿瘤条件下，由于其他原因E-cadherin减少或消失，而不能抑制Pyk2活性，导致Pyk2活性增强，因而肿瘤细胞迁移性增强。如果基于这个逻辑的话，实验设计就要改变为：磷酸化实验时应用酪氨酸激酶的通用底物E4Y1作为底物，观察E-cadherin对Pyk2激酶活性是否有抑制作用。然后筛选E-cadherin过表达、功能失活突变体和空载体的稳定表达肝癌细胞株，然后行细胞迁移实验和裸鼠成瘤实验，观察E-cadherin蛋白过表达或功能失活突变后与细胞迁移或者肿瘤转移的关系，同时检测其与Pyk2蛋白表达量及磷酸化水平相关性。但是申请人在完成γ- Protocadherins抑制Pyk2的活性的工作中曾取E-cadherin做对比参照，结果发现E-cadherin抑制Pyk2激酶活性不是很明显，因此这种可能性不大。
从上面的分析来看，本课题在理论和逻辑上是可行的。
2）本课题是本人前期工作的延续，本人对E-cadherin/Pyk2的研究非常熟悉，前期工作构建的质粒表达载体等为本课题的下一步研究提供了很多有利的条件。本课题组的成员对所需要的技术方法都很熟练，且都有相应的工作基础，可以在各个方面进行协作。
3）本课题所涉及的技术均为较成熟的技术，所需的设备和条件本校都具备。
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（四）本课题的特色与创新之处
1.本课题通过酵母双杂交新发现一个与E-cadherin相互作用的蛋白--非受体型酪氨酸激酶Pyk2，并证明两者的相互作用可靠，国内外研究至今未曾见过报道，具有国际先进性和独创性。（有报道二者的表达量与肿瘤转移的关系，但是二者直接相互作用未见报道。）
2. 本课题新发现Pyk2磷酸化E-cadherin影响肝癌细胞转移的机制，对于E-cadherin在肝癌转移过程中的分子机制有新的理解，因此具有独创性和先进性。
（五）年度研究计划及预期研究结果 1.年度研究计划
2011.01-2011.12 磷酸化实验确定二者的调节关系，肝癌组织内源免疫共沉淀确定相互
作用可靠，同时确定二者结合的结构域，磷酸化位点。蔗糖密度梯度超速离心，荧光共定位等相关的实验进一步确证二者共定位。同时收集病例标本，收集临床资料。纯化蛋白制备抗体。
2012.01-2012.12 细胞迁移实验，裸鼠成瘤肿瘤转移实验检测Pyk2的表达与
E-cadherin的磷酸化状态，以及细胞迁移的关系，确定其调节机制。同时完成E-cadherin/Pyk2的表达以及磷酸化状态与肝癌的分期、转移、预后、复发等临床指标的相关性分析。
2013.01-2013.12 补充实验遗漏，整理实验资料，统计处理实验数据，撰写论文。
2.预期研究结果
1)确定Pyk2能够磷酸化E-cadherin，以及二者相互作用的结构域以及磷酸化位点。 2)确定Pyk2通过磷酸化E-cadherin，从而影响肝癌细胞迁移和肿瘤转移。 3)确定在肝癌组织中E-cadherin蛋白水平、磷酸化状态和Pyk2表达量的相关性，以及二者的表达与肝癌转移的相关性。
4)在国外学术期刊上发表SCI论文2-4篇，其中影响因子大于5的有一篇以上。在国内核心期刊发表论文2-4篇，并在国内外学术会议交流。
5)培养研究生2-3名。
二、研究基础与工作条件 （一） 研究基础
第一步：为了研究肝癌转移的机制，首先选取E-cadherin（胞内段，以下实验同）为诱饵在肝脏的cDNA文库中做酵母双杂交，寻找与E-cadherin相互作用的蛋白。我们先选取的是LACZ系统蓝白斑筛选，但是因为背景高而放弃。后来选取CytoTRAP系统，背景明显减低，测序后有意义的基因有31个。其中有4个为Pyk2片段。通过克隆Pyk2基因全 长验证，确定二者在酵母中的相互作用是强阳性的（图1）。（同时验证Pyk2的同源蛋白
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FAK与E-cadherin相互作用为可疑弱阳性）。
图1 酵母双杂交（CytoTRAP系统）验证Pyk2与E-cadherin相互作用
pMyr-Lamin为阴性对照，pMyr-SB为阳性对照，E-Cad为E-Cadherin缩写，以下图示与此相同。Psos-E-Cad为诱饵蛋白。CytoTRAP系统酵母双杂交特点为两个蛋白如果不相互作用在25℃时可以生长，而在37℃则不能生长,如阴性对照pMyr-Lamin所示。两个蛋白如果相互作用则在两个温度下都能生长,如阳性对照pMyr-SB所示，pMyr-Pyk2与阳性对照相似。
第二步：原核表达E-cadherin和His-Pyk2进行GST-Pulldown。为了验证二者是直接结合，我们分别细菌中表达纯化GST-E-cadherin和His-Pyk2，可惜His-Pyk2全长非常难纯化，得不到纯化的蛋白。我们表达纯化了His-Pyk2的激酶部分。GST-Pulldown实验结果证实Pyk2的激酶部分能够与E-cadherin直接结合（图2）。
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图2 原核表达E-cadherin和His-Pyk2激酶部分进行GST-Pulldown。
分别原核表达GST、GST-E-cadherin和His-Pyk2激酶部分，取等量GST、GST-E-cadherin分别与相同量的His-Pyk2激酶部分混合，加入谷胱甘肽琼脂糖珠孵育，重复洗三次，用his抗体Western检测，结果显示His-Pyk2激酶部分能够与GST-E-cadherin结合（泳道3），而不能与GST结合（泳道2），泳道1上图是纯化的His-Pyk2激酶部分的蛋白作为检测标准。
第三步：原核表达E-cadherin和细胞表达Myc-Pyk2进行GST-Pulldown。我们转染Myc-Pyk2于SYF细胞（SYF细胞株是酪氨酸激酶c-Src, Yes,和Fyn敲除的胚鼠中的成纤维细胞建成的细胞系，用这个细胞株可以排除Src等其他非受体型酪氨酸激酶的干扰。），实验结果发现GST-E-cadherin可以与真核表达的Myc-Pyk2全长结合，而GST作为对照不能与之结合（图3）。
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图3 原核表达E-cadherin和细胞表达Myc-Pyk2进行GST-Pulldown。
转染Myc-Pyk2于SYF细胞，裂解细胞取上清，取等量GST、GST-E-cadherin分别与相同量的细胞上清混合，加入谷胱甘肽琼脂糖珠孵育，重复洗三次，用Myc抗体Western检测，结果显示Myc-Pyk2能够与GST-E-cadherin结合（泳道3），而不能与GST结合（泳道2），上图泳道1是细胞裂解液上清，检测到Myc-Pyk2蛋白作为Pulldown的参照。
第四步：我们在SYF细胞株中应用外源性免疫共沉淀技术验证，即Flag -E-cadherin和Myc-Pyk2共转染SYF细胞，结果证明二者仍然是相互作用的（图4）。
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图4 Flag -E-cadherin和Myc-Pyk2免疫共沉淀结果
三组SYF细胞分别转染Myc-Pyk2、Flag -E-cadherin和共转（泳道1，2，3），左侧Input：Western检测蛋白表达量；右侧IP（泳道4，5，6），下图（泳道5，6）检测用Flag抗体沉淀下来的Flag -E-cadherin，结果发现Myc-Pyk2能被Flag -E-cadherin沉淀下来（上图泳道6），而对照不能（上图泳道4，5））。
上述实验都重复三次以上确保可重复性。这些数据让我们相信二者的相互作用是比较可靠的。本课题是申请者在原工作基础上的继续和深入。申请者一直专注于肿瘤信号通路的研究，尤其是肝癌的转移方面。因此对本课题的背景和技术都非常熟悉。参加人员都有良好的科研背景以及相关方面的特长。因此，我们具有完成本课题的切实可行的、扎实的工作基础。
（二）工作条件
本课题组所在学校的附属医院具有病例收集的良好条件，同时学校领导非常支持，本校及合作单位拥有国家重点实验室，具有设备完善而先进的的分子生物学、细胞生物学、蛋白质组学、生物信息学、组织病理技术等实验平台。课题组的成员也具有团结协作创新的精神、求实的科学态度，多名成员已发表SCI论文，为本项研究工作提供有利的人力资源。
（三）申请人和项目组主要成员简历
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三、其他附件清单
医学伦理委员会审批件。
签字和盖章页(此页自动生成,打印后签字盖章)
解除保护[ 申 请 人： 依托单位：青岛大学
项目名称：Pyk2促进肝癌细胞迁移的一个新的分子机制研究：结合并磷酸化E-cadherin? 资助类别：面上项目 亚类说明： 附注说明：
申请人承诺：
我保证申请书内容的真实性。如果获得资助，我将履行项目负责人职责，严格遵守国家自然科学基金委员会的有关规定，切实保证研究工作时间，认真开展工作，按时报送有关材料。若填报失实和违反规定，本人将承担全部责任。
签字：
项目组主要成员承诺：
我保证有关申报内容的真实性。如果获得资助，我将严格遵守国家自然科学基金委员会的有关
规定，切实保证研究工作时间，加强合作、信息资源共享，认真开展工作，及时向项目负责人报送有关材料。若个人信息失实、执行项目中违反规定，本人将承担相关责任。 依托单位及合作研究单位承诺：
已按填报说明对申请人的资格和申请书内容进行了审核。申请项目如获资助，我单位保证对研究计划实施所需要的人力、物力和工作时间等条件给予保障，严格遵守国家自然科学基金委员会有关规定，督促项目负责人和项目组成员以及本单位项目管理部门按照国家自然科学基金委员会的规定及时报送有关材料。
依托单位公章 合作研究单位公章1 合作研究单位公章2
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