与解链方向相反，此时，必须等模板链解出足够长度，在引物3′-OH末端，沿5′→ 3′方向先合成小的DNA片段（冈崎片段），这些片段是不连续的，最后连成一条完整的链，称后随链（lagging strand）。前导链的连续性在许多因素作用下也会出现不连续性。如模板链的损伤、一条链上有多个复制起始点、复制因子和底物供应不足等，都会引起前导链复制的中断，并从一新的起始点开始复制。前导链和后随链是指同一复制叉上的两条链。
五、原核生物DNA的复制过程 （一）复制的起始
这是复制中较复杂的环节，参与因子较多，是把DNA解成单链和生成引物。
E.coli复制始于单个位点（oriC），有245bp的序列，一般含两个反向重复单位和三个串联重复单位。
解链是一种高速的反向旋转，其下游势必发生打结现象。拓扑酶通过切断、旋转和再连接作用，实现DNA超螺旋的转型，正超螺旋变负超；DnaA蛋白辩认并结合oriC重复序列的位点，解链酶（DnaB蛋白，rep蛋白）解开双链（DnaC蛋白协助解链）；SSB和引发酶进入，生成的引发体到达适当位置就可按模板催化NTP的聚合，生成引物，这标示复制起始的完成。后随链是不连续复制的，引发体需多次生成。
（二）复制的延长
DNA-polⅢ在引物的3′-OH端，按模板碱基序，催化加入的dNTPs生成磷酸二酯键，子链的延长按5′→3′方向延伸，其速度相当快。E.coli基因组，即全套基因染色体上的DNA约3 000kb。按20分钟繁殖一代，每秒加入的核苷酸数达2500bp。随从链先是生成若干短的冈崎片段，片段之间的连接由RNA酶水解去掉引物，留下的空缺（gap）由DNA-polＩ催化填补，再由DNA连接酶将两个片段连在一起。
（三）复制的终止
一般说来，复制的终止不需要特定的信号，未发现有关的酶。E.coli环状DNA是双向复制，起始点和终点刚好把环分为两个半圆，两个方向各进行180度，复制至最后的3′-OH末端，可延长填补起始复制时形成的引物所留下的缺口。
六、真核生物DNA的复制
真核生物基因组比原核生物大得多，其染色体以核小体为结构单位组成，因此DNA的复制过程相当复杂。其特点：
1.有多个复制原点，可分段复制。一个复制叉的移动速度虽比原核生物慢，且不连续，但利用多个复制原点可加速复制，所以总的复制速度还是快的。
2.真核生物DNA聚合酶有5种，以α、β、γ、δ、ε命名。polα主要催化合成引物，随从链多次合成的引物包含有DNA片段。polδ有解螺旋酶的活性，催化链的延长。β与ε修复DNA，γ复制线粒体DNA。
3.端粒复制
端粒（telomere）是真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。形态学上，像两顶帽子盖在染色体两端。端粒在维持染色体的稳定性和DNA复制的完整性上有重要作用。
线性DNA复制终止时，新链最早出现的5′-端引物被降解后，留下的空缺没法填补，导致DNA末端有可能缩短。事实上染色体多次复制并没有变短，这是因为端粒有一特化的DNA序，富含T、G短序列的多次重复。端粒酶可催化端粒的复制。
端粒酶（telomerase）是1985年发现的一种核糖核蛋白酶，由三部分组成：端粒酶RNA、端粒酶协同蛋白和端粒酶逆转录酶。该酶兼有提供RNA模板和催化逆转录的功能，通过一种称为爬行模型的机制维持染色体的完整。端粒酶结合后，依其RNA模板，在端粒单链3′-OH为引物基础上，不断反向转录，催化其延长，到一定长度，形成G-G配对的发夹结构，3′-OH端回折与互补链方向一致，端粒酶脱落，由DNA聚合酶催化，按新延伸的链为模板合成互补链。DNA末端复制变短和用端粒酶增加其长度，这两个过程处于平衡状态，所以染色体保持大致相同的长度。
第二节 反转录
一、反转录概念和反转录酶
反转录（reverse transcription）是以RNA为模板，由反转录酶催化dNTP合成DNA，又称逆转录或RNA指导的DNA合成。 1970年Temin和Baltimore分别从致癌RNA病毒中发现RNA指导的DNA聚合酶。逆转录酶催化的DNA合成反应要求有模板和引物，以4种脱氧核苷三磷酸为底物，此外还需适当浓度的Mg2+和还原剂（以保护酶蛋白中的巯基）,DNA链的延长方向是5′→3′。此酶是一种多功能酶，兼有3种酶的活力。①RNA指导的DNA聚合酶活力，即利用RNA为模板，在其上合成互补的DNA，形成RNA-DNA杂合分子；②核糖核酸酶H的活力，专门水解RNA-DNA杂合分子的RNA。③DNA指导的 DNA聚合酶的活力，在新合成的DNA链上合成另一条互补DNA链，形成双链DNA分子。
二、反转录过程和生物学意义
所有已知的致癌RNA病毒都含有反转录酶，又称反转录病毒。其生活周期十分复杂，最关键的是反转录过程。有10步反应，需反转录酶两次转换模板。先依RNA为模板先合成一条互补DNA（cDNA）链，形成RNA-DNA杂交体；随后核糖核酸酶（RNaseH）水解它，除去RNA得cDNA单链( 称负链DNA，记作DNA－)；继而以DNA(－)为模板合成DNA(+)。
反转录的发现证明遗传信息可以从RNA到DNA，传统的“中心法则”得以修正，1975年二人获诺贝尔生理学与医学奖。
研究表明，反转录病毒有致癌作用，其基因组含癌基因（oncogene，onc）。正常人的细胞基因组含原癌基因（pro-onc），在胚胎发育期有明显的表达，而成年个体极少表达。当一些化学致癌物诱发这些基因表达时，细胞将发生癌症（白血病等）。1983年发现的HIV是一类反转录病毒，感染人的T淋巴细胞即杀死细胞，造成人的免疫系统损伤，引起AIDS。
第三节 DNA损伤与修复
DNA复制的保真性是维持物种相对稳定的主要因素，而DNA复制时的错误是突变（mutation）发生的原因。突变是生物进化和细胞分化的分子基础。所以遗传的稳定性和突变的绝对性组成生物界对立统一的自然现象，使生物世界五彩缤纷。
一、DNA突变和损伤的概念
突变是指DNA分子碱基的改变或表型功能的异常变化。是通过复制而遗传给子代的永久性DNA序列的改变，逃脱或躲过细胞修复系统。DNA损伤通常指DNA序列可修复的变化（主要是DNA复制中一条链上经修复系统改正的变化）。
突变有自发和诱发两种，其表现是：只有基因型改变而无表型改变（DNA多态性和个体差异的基础）、表型改变（遗传病和遗传倾向性的病的原因）和致死性突变。在复制过程中自然发生的突变几率极低，约为10-9，而外界因素引起的诱变研究不断深入，其形式有：错配（点突变）、缺失、插入和倒位。
点突变指DNA分子上一个碱基的改变；缺失指一个碱基或一段核苷酸序列从DNA分子上消失；插入指一个或一段原来没有的核苷酸序列插入到DNA分子中间；倒位指DNA链内较大片段的重组（反置或内迁）。
物理因素多见于紫外线照射，引起DNA分子结构中出现嘧啶二聚体。化学因素主要有烷化剂、亚硝酸盐和抗生素及类似物。前两者引起DNA分子中碱基改变，后者能嵌入DNA双螺旋的碱基对之间，干扰和影响DNA的复制与转录。
二、DNA损伤的修复
DNA损伤和修复，是细胞内DNA复制中同时并存的两个过程。修复（repairing）是针对已发生的DNA损伤施行补救，可看作很小范围内的DNA合成。主要有光修复、切除修复、重组修复和SOS修复等。
1.光修复
从单细胞生物到鸟类都有光复合酶，可见光使该酶激活，并催化分解因紫外线照射而产生的嘧啶二聚体，使DNA损伤得以恢复。 2.切除修复
这是机体细胞内DNA损伤的主要修复方法。由特异的核酸内切酶、DNA-polＩ、DNA连接酶完成。其过程是：核酸内切酶水解核酸链内损伤部位的磷酸二酯键，造成一个缺口；DNA-polＩ在3′-OH端按碱基配对原则催化合成新的DNA片段，置换出的片段还由DNA-polＩ切除；DNA连接酶完成最后的修复。
着色性干皮病（xeroderma pigmentosis，XP）是一种人类遗传性皮肤病，DNA修复能力的缺陷可能是病因。患者对日光异常敏感，其皮肤受照射后，易诱发皮肤癌。
3.重组修复
当DNA分子损伤面较大，来不及修复就复制。其损伤部位失去模板作用，造成子链上的缺口，通过链间交换，可填补这缺口，而母链上的缺口由DNA-pol和DNA连接酶完成修复。原有的损伤部位还在，但随多次复制，损伤链所占比例减少。
4.SOS修复
当DNA损伤严重，细胞处在危急状态下的一种修复方式。这种修复反应特异性低，DNA保留的错误较多，会引起突变，但细胞尚可存活。
第四节 基因重组与DNA克隆
一、基因重组
DNA分子内或分子间发生遗传信息的重新组合，称为遗传重组或基因重组。重组产物称为重组DNA。DNA的重组广泛存在于各类生物。其功能：①在DNA损伤修复中起关键作用，没有重组，损伤和突变不会被消除。②重组和转座产生基因新的组合，供自然选择。③调节DNA表达。
20世纪60年代末，在细菌体内陆续发现一类能识别DNA的特异序列，且在识别序列内或附近切开DNA双链的核酸水解酶，称为限制性核酸内切酶（简称限制酶）。这类酶可将侵入宿主细胞的外源性DNA迅速切开，进而被脱氧核糖核酸酶水解，有防止病毒感染宿主细胞的作用。而对细菌自身的DNA则会通过甲基化酶在该种限制酶切位点的甲基化修饰而得到保护。所以，限制酶和甲基化酶共同构成细菌的限制-修饰系统。
限制酶是一类重要的工具酶，到1999年10月已得到3154种，主要根据其来源菌株，依属、种、株三字母命名，若从同一微生物发现的多种限制酶，则依发现和分离前后的顺序用罗马数字表示。根据限制酶识别切割特性和催化条件有Ｉ、Ⅱ、Ⅲ型，重组DNA中常用的是Ⅱ型。限制酶只有限制性内切作用而无修饰功能，识别序列一般有4~6个碱基对，多数能识别廻文结构DNA序（具有二次旋转对称性）。例如大肠杆菌DNA限制酶EcoRⅠ的切口是交错的，产生能彼此配对的粘端（sticky end），切口是齐头的，产生平端（blund end）。由同一个限制酶切断得到的任何两个DNA片段的粘性末端都可以互相配对，再通过DNA连接酶连接，创建重组DNA分子。
1972年，美国学者Berg等人首次在体外把SV40（一种猴病毒）的DNA和噬菌体DNA用限制性内切酶分别切割，又将两者接在一
起，成功地构建了第一个体外重组的人工DNA分子。
1973年，Cohen等人首次将体外重组的DNA分子导入大肠杆菌中，成功地进行了无性繁殖，从而完成了DNA体外重组和扩增的全过程。由此诞生基因工程这门新兴学科。
二、DNA克隆
克隆（clone）是指通过无性繁殖产生在基因型和表型上与亲代完全相同的子代群体。DNA克隆是指在体外对DNA分子按照既定目的分离、剪切和人工重组，然后将重组分子导入合适的宿主细胞，使其扩增的过程。
大部分外源DNA片段不能在细胞中自我复制，必须连到一个可以自主复制的载体（病毒或质粒DNA）上，然后转入宿主细胞复制。这样，外源DNA可以纯化形式重新获得大量拷贝。因在分子水平上操作，又称分子克隆。由于研究对象常是特异的基因片段，所以又称基因克隆。
基因载体（vector）是供插入目的基因并将其导入宿主细胞内复制或表达的运载工具。其基本条件是：能自主复制并能带动插入的目的基因一起复制；具有一个以上的单一限制性酶切位点，以便目的基因插入；具有合适筛选标记（如抗药性基因，酶基因等）；载体分子量小，可插入较大的目的基因而不影响复制；在细胞内稳定性高，以便确保重组体稳定传代而不易丢失。
质粒（plasmid）是一种独立于染色体外，能进行自主复制的细胞质遗传因子。主要存在于微生物，细菌中含量最丰富。质粒控制多种不同的遗传性状，尤其与细菌的抗药性、致病性有关。
λ-噬菌体是一种大肠杆菌病毒，为线性双链DNA，它的两端各有12个碱基的互补粘性末端，称cos位点。当噬菌体侵入宿主细胞，两个粘性末端互补结合，形成环状分子。λ-DNA在体外可包装成病毒颗粒，并高效感染大肠杆菌。天然的质粒、噬菌体、病毒都需经人工改构才可为理想的载体。质粒、噬菌体常用于原核细胞为宿主的分子克隆，动物病毒常用于真核细胞为宿主的分子克隆。
三、聚合酶链式反应（PCR）
PCR是一种体外快速的特定DNA片段扩增技术。Mullis于1985年发明，其基本原理是根据DNA复制机制及DNA在体外随温度发生变性和复性的特点设计的。
一个PCR反应包括靶DNA（含目的DNA的样品）、引物（人工合成的与靶DNA的3′端序列互补杂交）、4种dNTP和热稳定的DNA聚合酶等。然后置高温950C（15~30秒）下使靶DNA变性解链，反应混合物被迅速冷却（单链DNA与引物结合的退火温度要认真计算，45~550C），再升高温度置70~750C左右，由TDNA聚合酶催化引物延伸合成子链。PCR的高温变性—低温退火—适温延伸三步反应反复循环，使靶DNA在两段引物限定范围内的序列以几何级数扩增。20个循环，起始DNA即扩增百万倍，30个循环后，扩增亿倍，全部所需时间不到1小时。PCR已广泛应用于生物学各个领域，如基因工程、DNA测序、筛选人类遗传疾病、病原微生物检测、法医学鉴定等。
概括起来，基因工程（genetic engineering）包括以下几个主要内容： 1.从复杂的生物体基因组中分离出目的基因片段。
2.在体外，将目的基因片段连接到能自我复制的并且具有选择标记的载体分子上，形成重组DNA分子。 3.将重组DNA分子转移到适当的宿主细胞（又称受体细胞），并与之一起增殖。 4.筛选出获得重组DNA的受体细胞克隆。
5.从筛选出的阳性克隆中提取扩增的目的基因片段，供研究。 6.将目的基因克隆到表达载体上，导入宿主细胞，使之实现功能表达。
第十章 RNA的生物合成(转录)
教学目标：
1.掌握转录的概念和转录体系的组成。
2.熟悉原核生物转录的基本过程。比较真核生物的转录与原核生物不同。 3.了解RNA转录后加工的方式（内含子、外显子、核酶的概念）。 4.了解RNA复制的概念。
导入：从生物化学意义上说，基因(gene)是为生物活性产物编码的DNA功能片段，这些产物是各种RNA和蛋白质。基因表达包括细胞的遗传信息从DNA到RNA，再由RNA到蛋白质。前者称为转录，后者称为翻译。
第一节 转录
一、转录的概念和特点
转录（transcription）是DNA指导下的RNA合成过程，即DNA模扳的碱基序转抄成RNA的碱基序列。转录和复制有许多相似之处：都是酶促的核苷酸聚合过程；都以DNA为模板；都需依赖DNA的聚合酶；都按模板链的碱基配对原则和5′→ 3′方向在核苷酸之间生成磷酸二酯键，且延伸新链。不同的是：
1.不对称转录
转录不像复制要保留细胞的全部遗传信息，而是在细胞不同的发育时序，按生存条件和生理需要，部分遗传信息（结构基因）的表达。所以转录对基因组庞大的DNA链有选择性，这种选择是不对称的（asymmetric）。即DNA分子中进行转录的某一活化基因区段称模板链（template strand），与其对应的互补链不转录，称编码链（coding strand）。对各种基因来说，模板链并非总在同一条单链上。
2.RNA聚合酶（又称DNA指导的RNA聚合酶，DDRP）
该酶广泛存在于原核生物和真核生物中，以4种NTP为底物，无需引物，直接在模板上合成RNA链。
原核生物中所有的RNA都由一种RNA聚合酶合成。大肠杆菌RNA- pol分子量为460kDa，由5个亚基组成，分别为α2、β、β＇、ζ。α2ββ＇称为核心酶，只能使已开始合成的RNA链延长，不具有起始合成RNA的能力，ζ因子有识别转录起始位点的作用。启动转录只有全酶与模板DNA启动子结合才发挥作用。
真核生物RNA- pol有多种，分子量大致都在500kDa左右。 DDRPⅠ分布在核仁，合成rRNA前体 DDRPⅡ分布在核质，合成mRNA，hnRNA DDRPⅢ分布在核质，合成tRNA，5SrRNA，snRNA 线粒体RNA聚合酶合成线粒体RNA 二、转录过程
转录是包括起始—延伸—终止的连续过程。原核生物的转录和真核生物的转录在起始和终止上有较多的不同。 （一）启动子和起始
启动子（promoter）是指RNA聚合酶识别、结合并开始转录的一段DNA序列。
原核启动子发现有两个重要序列，一个位于转录起始位点上游10个核苷酸处（习惯上被转录为RNA的DNA模板上的第一个核苷酸指定为+1，即转录起始位点），另一个位于上游35个核苷酸处，它们分别称为－10序列和–35序列。－10序列富含TATAAT，称之TATA box或Pribnow box。该序列富含AT，维持双链结合的氢键相对较弱，易发生解链，是RNA聚合酶的核心酶结合部位。－35序列富含TTGACA，是RNA聚合酶ζ亚基的识别部位。实验可知原核生物RNA聚合酶作用的区域为－50~+20。
在转录起始阶段，RNA聚合酶识别将拷贝的基因的上游DNA（即启动子），局部解开双链（特别是TATA box处，约17个bp），当酶移至转录起始位点（+1处），催化按模板链碱基序依次排列的头两个三磷酸核苷聚合，生成RNA链的第一个3′，5′-磷酸二酯键，第一个核苷酸一定是三磷酸嘌呤核苷酸，而且pppG较pppA又占绝对优势，5′-端的pppG这一末端结构一旦生成，一直保持到转录完成。
（二）延伸
转录起始后，RNA聚合酶、DNA模板以及第一个聚合生成的四磷酸二核苷酸（即5′pppGpN-OH3′）三者形成一个复合体，此时ζ亚基脱落（与另一核心酶结合而重复使用），核心酶沿DNA链的3′→5′方向移动（转录方向），而RNA链按5′→3′方向延伸。由RNA聚合酶、DNA模板和新生RNA组成的区域叫做“转录泡”（transcription bubble）。新生RNA与DNA模板链暂时形成短的杂交双链（长度约为12bp），这有利于正确阅读模板链的碱基序，但A=U配对稳定性最低。在延伸阶段约有DNA的20个bp被解开，延伸速率约每秒50个核苷酸，在此时间内转录泡移动17.0nm。当RNA从DNA上脱离，暂时局部解开的双链及时复合。
研究发现，在同一DNA模板上，有许多RNA聚合酶同时结合其上，同步催化转录作用，从转录起始点到终止点有一系列长短不一的新生RNA链，它们逐渐加长和不断延伸，还被排斥于DNA模板之外。
（三）终止子和终止
终止子（terminator）是指所转录的RNA行将结束时，模板DNA分子上出现的有终止信号的序列，它可被RNA聚合酶本身或其辅助因子所识别。
E.coli有两类终止子：①不依赖ρ因子的，称简单终止子。该终止子有一特殊序列与终止有关，称回文序列（它是两段由多个GC碱基对组成的反向重复序列），随后相连AT序列，因为回文DNA上合成的RNA是自身互补的，可以形成发夹结构，该结构可使RNA聚合酶减慢移动或暂停RNA合成，导致转录终止；此外，模板DNA5′-末端的AT区中含有一连串A，故在转录出的RNA链的3′-终止端为一连串的U （polyU约有6个），它提供信号使RNA聚合酶脱离模板，RNA链从DNA链上解离（U-A结合最弱）。②依赖ρ因子的终止子，其回文结构不富含G-C序。ρ因子是由6个亚基组成的一种“终止蛋白质”，有RNA-DNA解旋酶的活力。它结合在新生的RNA链上，借助水解NTP获得的能量推动其沿RNA链移动，但速度比RNA聚合酶慢，当聚合酶遇到终止子时发生暂停，ρ因子得以赶上酶，并相互作用，导致释放RNA，并使聚合酶与它一起从DNA上脱离。
（四）真核生物中的基因转录
1.真核生物基因组构复杂，大部分蛋白质编码基因是不连续的，编码序列（称外显子exon）被非编码序列（内含子intron）中断。 2.不同的物种、不同细胞或不同的基因可以有不同的上游DNA序列，统称为顺式作用元件（cis-acting element），DDRPⅡ识别的大部分启动子在–25bp处有一个TATAbox（赫哥尼斯盒）。能直接或间接辩认、结合转录上游区段的蛋白质统称反式作用因子（trans-acting factor），直接或间接结合RNA聚合酶的，则称为转录因子（transcriptional factor，TF）。
3.转录起始，需要几个TFⅡ先后与启动子装配成复合物，进而协助DDRPⅡ结合形成转录起始复合物。
4.DDRPⅡ不在特定的位点终止，会在基因下游不同距离处终止，和转录后加工有关。由DDRPⅡ从蛋白质编码基因上合成的RNA分
子称原始转录物（或称RNA前体）。
（五）转录过程的抑制剂
转录过程的选择性抑制可通过与DNA结合改变模板功能或抑制RNA聚合酶的活性阻止RNA的合成。前者有放线菌素D，对原核和真核均有专一抑制作用；后者有利福平、α-鹅膏蕈碱等。利福平仅阻止原核RNA的合成，α-鹅膏蕈碱则是真核细胞中RNA合成的专一抑制剂，通过DDRPⅡ阻止mRNA的合成。
第二节 转录后加工
一、mRNA加工
原核细胞合成的mRNA不需要或很少需要加工，许多mRNA甚至在合成前就开始翻译。
真核细胞mRNA的前体是hnRNA（不均一核RNA），hnRNA分子量大，半衰期很短，其加工过程比较复杂，包括5′- 端加帽、3′- 端加尾和中段序列的剪接，一般在核内进行。
1. 帽结构
hnRNA合成一结束，5′-端就被加上一个甲基化的鸟嘌呤帽（capO），帽子结构是5′m7GpppGp。形成过程是磷酸酶将其末端磷酸基除去，和GTP作用形成5′5′三磷酸键，接着在甲基化酶的作用下，由S-腺苷酸甲硫氨酸提供甲基加到末端的鸟嘌呤上形成capO。甲基可以加到G后面的第一个核苷酸的核糖上形成cap1或加到G后面两个核苷酸上形成cap2。该结构的功能可能对mRNA的稳定和它在翻译中起识别作用有关。
2. 3′端加尾
帽化后的hnRNA由核酸内切酶切去3′端一些过剩的核苷酸，3′端切除信号在高等真核细胞是靠近3′端区有一段保守序列AAUAAA，也是多聚腺苷酸化的信号，多聚腺苷酸聚合酶再以ATP为底物催化形成polyA尾（约100~200个）。polyA尾的功能是保护最终的mRNA3′端免受核酸酶的降解而稳定mRNA。
3. RNA剪接（RNA splicing）
剪接在加帽加尾后进行。由核酸内切酶把内含子和外显子连接的磷酸二酯键水解，去除内含子，把相邻外显子的末端连接生成功能性mRNA。不同的剪接途径允许由单个基因合成几种不同的蛋白质。
内含子5′剪切位点总是以GU开始，3′剪切位点以AG结束且上游有一个含A的分支点和保守的嘧啶序。
剪接反应涉及两步转酯反应并在剪接体装配后进行。分支点中腺苷酸残基的2′- OH攻击5′剪切位点的3′5′磷酸二酯键，使该键断裂；内含子5′回折与分支点上的A形成不寻常的2′5′键（内含子似牛仔的套索）；外显子1的新3′OH攻击3′剪切位点的磷酸二酯键，使得两个外显子连接，释放套索状的内含子。两步转酯反应中，因磷酸酯键的数目没有改变，所以没有ATP的消耗。
RNA剪接需要核内小核糖核蛋白（snRNP）和一些辅助蛋白质，这些蛋白质在将被去除的内含子上装配为剪接体。snRNP由snRNA与一些蛋白质结合形成，snRNA似乎是执行催化作用（催化性的RNA称为核酶）。
成熟的mRNA通过核膜孔转运到细胞质，指导蛋白质的合成。 二、tRNA加工
原核和真核细胞tRNA的基因转录产物为tRNA前体，通过加工形成成熟的tRNA，各种tRNA的前体结构和加工方式不尽相同，一般加工过程包括：
1. 核酸内切酶切断tRNA两端
核酸内切酶不同于DNA限制性内切酶，它不能识别特异的序列，所识别的是加工部位的空间结构。大肠杆菌核糖核酸酶P（RNaseP）是一类切断前体5′端的加工酶，切除3′端的为RNaseF。真核生物tRNA前体中的内含子位于反密码子环上，由RNA剪接反应除去，不同于mRNA的剪接反应的是不涉及转酯反应。
2. 核酸外切酶（RNaseD）从3′端逐个切除附加序列
3. 3′端加CCA-OH结构，催化反应的酶是tRNA核苷酰转移酶（有些细菌tRNA不需要这种加工）。 4. 修饰碱基的形成，由特异性的tRNA修饰酶作用形成甲基化碱基、二氢尿嘧啶等。 三、rRNA的加工
原核和真核细胞合成蛋白质需要大量的核糖体，要求存在大量的rRNA基因拷贝，转录产物是较长的rRNA前体。
原核的30S rRNA前体分子被特异的核糖核酸酶切割产生23S、16S和5S rRNA及一个tRNA。RNaseⅢ催化裂解产生23S和16S rRNA；RNaseE从前体的3′端切割产生5S rRNA。
大部分真核生物，包括人类，有大于100个拷贝的rRNA基因，18S、5.8S 、28SrRNA基因特征性地成蔟分布并串联重复，RNA聚合酶Ⅰ转录rRNA基因，每转录一次包含18S、5.8S 、28S 的基因即产生一个45S rRNA前体。然后在核仁中进行加工。加工需要核仁小RNA（snoRNA），还涉及前体中18S和28S rRNA区域的大量甲基化。核仁小RNA与一些特异蛋白质偶联构成核仁小核糖核蛋白（snoRNP），以类似snRNP介导的mRNA剪接相似的方式进行加工。5S rRNA基因拷贝存在与以上基因不同的位点，由RNA聚合酶Ⅲ转录，转移到核仁中不再加工且装配到核糖体。
1982年美国的Cech等发现四膜虫大核rRNA前体在成熟过程中能进行自我剪接，加拿大的Altman等发现RNaseP分子中的RNA组